Elucidation of the mechanisms underlying cellular responses triggered by necroptosis

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Homeostatic Regulation by Various Types of Cell Death
• Project/Area Number: 26110003
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 中野 裕康 東邦大学, 医学部, 教授 (70276476)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大村谷 昌樹 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (60398229)
• Project Period (FY): 2014-07-10 – 2019-03-31
• Keywords: cFLIPs / アポトーシス / ネクロプトーシス / 腸炎 / Reg3b / IL-22 / SPINK1 / 慢性膵炎

Outline of Annual Research Achievements

（目標1-1）Crispr/Cas9法を用いて樹立したReg3b及びReg3g単独欠損マウスはそれぞれメンデルの法則に従い出生し、ストレスを与えない状況では腸炎を発症しないことが明らかとなった。そこでcFLIPs TgマウスとReg3b KOマウス、Reg3gKOマウスと交配した。Reg3gKOマウスとの交配では、メスcFLIPs Tg（XTgX）マウスの出生率の増悪は認められなかったものの、Reg3b KOマウスと交配したところ明らかにXTgX;Reg3b+/-マウスと比較して、XTgX;Reg3b-/-マウスの出生率は低下していることが明らかとなった。腸管障害に伴う胎児期のReg3bやReg3gの発現誘導のメカニズムを検討中である。
（目標1-2）cFLIPs Tgマウスで見られる腸管上皮障害にけるネクロプトーシスやアポトーシスの役割を明らかにするために、ネクロプトーシスに必須の遺伝子であるMlklやネクロプトーシスにキナーゼ活性の関与が示されているRipk1のキナーゼ変異体(Ripk1DN)マウスとcFLIPs Tgマウスとを交配した。両マウスのKOマウスと交配することで、胎生致死となっていたXTgYマウスの表現型が部分的にレスキューされた。

（目標2)ヒト遺伝性膵炎の原因遺伝子SPINK1とRipk3欠損マウスとの交配の結果、膵線維化が軽減することから、ネクロプトーシスが腺房細胞死、線維化を引き起こしている可能性が示唆された。そこで、組織修復に関与する因子を探索するために、出生直後のマウス膵臓をマイクロアレイで解析した結果、Reg3bおよび Reg3gの発現が著明に上昇することを見出した。つまりReg3ファミリー分子がダイイング・コードとなって膵星細胞の活性化を促進し、線維化を引き起こしている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

（目標1)当初予定していたReg3bKO, Reg3gKO, Mlkl KOマウスやRipk1DNマウスとの交配はすでに終了し、それぞれの遺伝子産物の腸管上皮障害への関与を明らかにできている。さらに胎児期におけるIL-22やReg3bの発現機構のメカニズムに迫りつつあり、ネクロプトーシスとアポトーシスのクロストークを明らかにできるin vivoモデルマウスを樹立できたことを確認しており、研究は予想以上に進捗していると考えられる。
（目標2)慢性膵炎のダイイングコードの同定を目指して、遺伝子発現解析をしてきたが、その候補遺伝子としてReg3bとReg3gを同定した。cFLIPs Tgマウスの解析のために既にReg3bKO, Reg3gKOマウスは既に樹立しており、慢性膵炎モデルマウスとの交配をすぐ開始しできており、研究は予想以上に進捗している。

Strategy for Future Research Activity

（目標1）胎児期の腸管においてもIL-22依存性にReg3bの発現が誘導されるとするならば、IL-22産生に関与する細胞が胎児期の腸管上皮障害により、非常に強く活性化されている可能性を示している。候補として一番考えられる細胞がRORgt陽性の３型自然リンパ球であることから、この細胞の腸管上皮障害への関与を検討する予定である。また腸管上皮障害がネクロプトーシスを抑制することで、アポトーシスも抑制されたことから、一つの可能性としてネクロプトーシスに伴い放出されたDAMPsがアポトーシスを誘導している可能性がある。この可能性について検討する予定である。
(目標2) 樹立したReg3bKO, Reg3gKOマウスと慢性膵炎マウスとの交配を行っており、今後、膵星細胞の活性化、膵線維化を指標として、Reg3分子のダイイング・コードとしての役割を明らかにしていく。さらに、Reg3bとReg3g遺伝子は同一染色体近傍に位置し、Crispr/Cas9を用いた二重変異マウスの作出、それぞれの遺伝子を欠損した線維芽細胞の樹立を行う準備を進めている。

Research Products

• [Int'l Joint Research] WEHI(Australia)
  • Country Name: Australia
  • Counterpart Institution: WEHI
• [Int'l Joint Research] Cologne University(Germany)
  • Country Name: Germany
  • Counterpart Institution: Cologne University
• [Int'l Joint Research] Vrije Universiteit(Netherlands)
  • Country Name: Netherlands
  • Counterpart Institution: Vrije Universiteit
• [Journal Article] HTLV-1 Tax Induces Formation of the Active Macromolecular IKK Complex by Generating Lys63- and Met1-Linked Hybrid Polyubiquitin Chains (2017)
  • Author(s): Shibata, Y. Tokunaga, F. Goto, E. Komatsu, G. Gohda, J. Saeki, Y. Tanaka, K. Takahashi, H. Sawasaki, T. Inoue, S. Oshiumi, H. Seya, T. Nakano, H. Tanaka, Y. Iwai, K. Inoue, J. I.
  • Journal Title: PLoS Pathog Volume: 13 Pages: e1006162
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1006162
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Depletion of myeloid cells exacerbates hepatitis and induces an aberrant increase in histone H3 in mouse serum (2017)
  • Author(s): Piao, X. Yamazaki, S. Komazawa-Sakon, S. Miyake, S. Nakabayashi, O. Kurosawa, T. Mikami, T. Tanaka, M. Van Rooijen, N. Ohmuraya, M. Oikawa, A. Kojima, Y. Kakuta, S. Uchiyama, Y. Tanaka, M. Nakano, H.
  • Journal Title: Hepatology Volume: 65 Pages: 237-252
  • DOI: 10.1002/hep.28878
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Critical contribution of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2) to electrophile-induced Interleukin-11 production (2017)
  • Author(s): Nishina, T. Deguchi, Y. Miura, R. Yamazaki, S. Shinkai, Y. Kojima, Y. Okumura, K. Kumagai, Y. Nakano, H.
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 292 Pages: 205-216
  • DOI: 10.1074/jbc.M116.744755
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Cellular FLICE-Inhibitory Protein Regulates Tissue Homeostasis (2017)
  • Author(s): Nakano, H. Piao, X. Shindo, R. Komazawa-Sakon, S.
  • Journal Title: Curr Top Microbiol Immunol Volume: 403 Pages: 119-141
  • DOI: 10.1007/82_2015_448
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Short form FLICE-inhibitory protein promotes TNFalpha-induced necroptosis in fibroblasts derived from CFLARs transgenic mice (2016)
  • Author(s): Shindo, R. Yamazaki, S. Ohmuraya, M. Araki, K. Nakano, H.
  • Journal Title: Biochem Biophys Res Commun Volume: 480 Pages: 23-28
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2016.10.015
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Novel method to rescue a lethal phenotype through integration of target gene onto the X-chromosome (2016)
  • Author(s): Sakata, K. Araki, K. Nakano, H. Nishina, T. Komazawa-Sakon, S. Murai, S. Lee, G. E. Hashimoto, D. Suzuki, C. Uchiyama, Y. Notohara, K. Gukovskaya, A. S. Gukovsky, I. Yamamura, K. I. Baba, H. Ohmuraya, M.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 6 Pages: 37200
  • DOI: 10.1038/srep37200
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] C-Type Lectin Receptor DCAR Recognizes Mycobacterial Phosphatidyl-Inositol Mannosides to Promote a Th1 Response during Infection. (2016)
  • Author(s): Toyonaga K, Torigoe S, Motomura Y, Kamichi T, Hayashi JM, Morita YS, Noguchi N, Chuma Y, Kiyohara H, Matsuo K, Tanaka H, Nakagawa Y, Sakuma T, Ohmuraya M, Yamamoto T, Umemura M, Matsuzaki G, Yoshikai Y, Yano I, Miyamoto T, Yamasaki S.
  • Journal Title: Immunity Volume: 45 Pages: 1245-1257
  • DOI: doi: 10.1016/j.immuni.2016.10.012
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] High-density array-CGH with targeted NGS unmask multiple noncontiguous minute deletions on chromosome 3p21 in mesothelioma. (2016)
  • Author(s): Yoshikawa Y, Emi M, Hashimoto-Tamaoki T, Ohmuraya M, Sato A, Tsujimura T, Hasegawa S, Nakano T, Nasu M, Pastorino S, Szymiczek A, Bononi A, Tanji M, Pagano I, Gaudino G, Napolitano A, Goparaju C, Pass HI, Yang H, Carbone M.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 113 Pages: 13432-13437
  • DOI: 10.1073/pnas.1612074113
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Opposing roles for SNAP23 in secretion in exocrine and endocrine pancreatic cells. (2016)
  • Author(s): Kunii M, Ohara-Imaizumi M, Takahashi N, Kobayashi M, Kawakami R, Kondoh Y, Shimizu T, Simizu S, Lin B, Nunomura K, Aoyagi K, Ohno M, Ohmuraya M, Sato T, Yoshimura SI, Sato K, Harada R, Kim YJ, Osada H, Nemoto T, Kasai H, Kitamura T, Nagamatsu S, Harada A.
  • Journal Title: J Cell Biol Volume: 215 Pages: 121-138
  • DOI: 10.1083/jcb.201604030
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Protein kinase D regulates positive selection of CD4+ thymocytes through phosphorylation of SHP-1 (2016)
  • Author(s): Ishikawa E, Kosako H, Yasuda T, Ohmuraya M, Araki K, Kurosaki T, Saito T, Yamasaki S
  • Journal Title: Nat Commun Volume: 7 Pages: 12756
  • DOI: 10.1038/ncomms12756
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Heterogeneity of KRAS Mutations in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (2016)
  • Author(s): Hashimoto D, Arima K, Yokoyama N, Chikamoto A, Taki K, Inoue R, Kaida T, Higashi T, Nitta H, Ohmuraya M, Hirota M, Beppu T, Baba H
  • Journal Title: Pancreas Volume: 45 Pages: 1111-1114
  • DOI: 10.1097/MPA.0000000000000624
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Short form FLICE-inhibitory protein promotes TNFα-induced necroptosis in fibroblasts derived from CFLARs transgenic mice (2017)
  • Author(s): Ryodai Shindoa, Soh Yamazakia, Masaki Ohmuraya, Kimi Araki, Hiroyasu Nakano.
  • Organizer: Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology
  • Place of Presentation: Keystone, Colorado, USA
  • Year and Date: 2017-02-07
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Analysis of Interleukin-11-producing cells in a colitis-associated cancer model using IL-11 reporter mice (2017)
  • Author(s): Takashi Nishina, Yutaka Deguchi, Eri Nakamura, Yuko Kojima, Norihiro Tada, Hiroyasu Nakano
  • Organizer: Keystone Symposia on Molecular and Cellular Biology
  • Place of Presentation: Keystone, Colorado, USA
  • Year and Date: 2017-02-07
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 電子顕微鏡を用いたネクロプトーシスの微細構造の解析 (2016)
  • Author(s): 三宅早苗, 角田宗一郎, 小池正人, 内山安男, 中野裕康
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神奈川県横浜市西区パシフィコ横浜
  • Year and Date: 2016-12-02
• [Presentation] アポトーシス細胞は腸内細菌非依存的にReg3βを産生し腸管の恒常性を維持する (2016)
  • Author(s): 進藤綾大、大村谷昌樹、駒澤幸子、三宅早苗、山崎創、仁科隆史、小西博之、木山博資、三上哲夫、荒木喜美、中野裕康
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-27
• [Presentation] 肝細胞死亢進マウスを用いた肝幹細胞増殖因子同定の試み (2016)
  • Author(s): 土屋勇一, 田中稔, 鶴崎慎也, 及川彰, 駒澤幸子, 三上哲夫, 中野裕康
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-26
• [Presentation] 細胞死制御因子cFLIPの肝細胞特異的欠損マウスを用いた肝障害モデルにおけるクッパー細胞および骨髄由来細胞の役割 (2016)
  • Author(s): 朴 雪花, 山﨑 創, 駒澤-左近 幸子, 三宅 早苗, 中林 修, 田中 稔, 大村谷 昌樹, 及川 彰, 角田 宗一郎, 内山 安男, 田中 正人, 中野 裕康
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-26
• [Presentation] 肝細胞死亢進マウスモデルを用いた肝再生や炎症制御のメカニズムの解明 (2016)
  • Author(s): 中野裕康
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-25
  • Invited
• [Presentation] 親電子リガンドによるIL-11産生機構とその生体における役割の解明 (2016)
  • Author(s): 仁科 隆史、出口 裕、三浦 亮介、新開 泰弘、小島 裕子、熊谷 嘉人、中野 裕康
  • Organizer: 第89回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-09-25
• [Presentation] ネクロプトーシスをモニターするFRETプローブの開発 (2016)
  • Author(s): 村井 晋, 山口 良文, 中林 修, 冨田 太一郎, 赤羽 悟美, 三浦 正幸, 中野 裕康
  • Organizer: 第25回 日本Cell Death学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都品川区きゅりあん
  • Year and Date: 2016-09-10
• [Presentation] ネクロプトーシスと遺伝性膵炎 (2016)
  • Author(s): 大村谷昌樹
  • Organizer: 第25回 Cell Death学会学術集会
  • Place of Presentation: 東京都品川区きゅりあん
  • Year and Date: 2016-09-09
• [Presentation] CD4+ T cell-intrinsic TRAF5 negatively regulates Th17 cell-dependent experimental autoimmune encephalomyelitis (2016)
  • Author(s): Hiroyuki Nagashima, Yuko Okuyama, Takaya Hayashi, Atsuko Asao, Takeshi Kawabe, Satoshi Yamaki, Hiroyasu Nakano, Michael Croft, Naoto Ishii, Takanori So.
  • Organizer: 第16回国際免疫学会議
  • Place of Presentation: オーストラリア、メルボルン
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] TRAF adaptors limit the IL-6 receptor signaling through an unexpected binding to the signaling transducer receptor gp130. (2016)
  • Author(s): Takanori So, Hiroyuki Nagashima, Yuko Okuyama, Takaya Hayahi, Atsuko Asao, Takeshi Kawabe, Satoshi Yamaki, Hiroyasu Nakano, Michael Croft, Naoto Ishii.
  • Organizer: 第16回国際免疫学会議
  • Place of Presentation: オーストラリア、メルボルン
  • Year and Date: 2016-08-21
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The Roles of Cathepsin B, D, and L during Acute and Chronic Pancreatitis in Mice (2016)
  • Author(s): Masaki Ohmuraya, Kazuya Sakata, Olga Mareninova, Kenji Notohara, Ilya Gukovsky, Anna Gukovskaya
  • Organizer: 20th meeting of the International Association of Pancreatology
  • Place of Presentation: 宮城県仙台市青葉区仙台国際センター
  • Year and Date: 2016-08-04
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] Apoptotic and non-apoptotic cell death (2017)
  • Author(s): Shigekazu Nagata, Hiroyasu Nakano
  • Total Pages: 183
  • Publisher: Springer International Publishing AG
• [Book] 新膵臓病学 (2017)
  • Author(s): 下瀬川徹 編集（大村谷昌樹 分担執筆）
  • Total Pages: 515
  • Publisher: 南江堂
• [Remarks] 東邦大学医学部生化学講座ホームページ
  • URL: http://tohobiochemi.jp/