新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド形成システムの解明

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 26116005
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 稲葉 謙次 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (10423039)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 門倉 広 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (70224558)
• Project Period (FY): 2014-07-10 – 2019-03-31
• Keywords: タンパク質品質管理 / ジスルフィド結合 / X線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

平成27年度は、平成26年度に引き続きジスルフィド結合形成モニタリング系の開発をすすめた。様々なステップにおける条件検討の結果、小胞体内に送り込まれてくるLDL受容体(LDLR)の新生鎖にジスルフィド結合が導入される過程を観察するため系の開発に成功した。その結果、遅くともLDLRの新生鎖が約70kDaの大きさに伸長した時点でジスルフィド結合が導入されることが判明した。一方、上記モニタリング系では近接したシステイン間に形成されたジスルフィド結合の検出が容易ではないことも判明した。そこで、新生鎖中の近接したシステイン間に形成されたジスルフィド結合でも検出可能なシステムを新たに着想し、構築した。更に、ジスルフィド結合形成交換反応の際に、基質であるLDLRとPDIファミリータンパク質の間に形成される複合体を精製し、その質量分析からLDLRと相互作用するPDIファミリータンパク質を網羅的に同定することにも成功した。
さらに、ヒト細胞の小胞体における主要なジスルフィド結合形成酵素Ero1の活性制御機構について構造生化学的研究を進めた。具体的には、X線小角散乱法によるEro1の溶液構造を決定すると同時、Ero1のPDI酸化活性がCys94-Cys131間のジスルフィド結合の還元だけでなく、Cys208-Cys241間のジスルフィド結合の還元によっても亢進されることを発見した。さらに、これらジスルフィド結合を還元するのは基質であるPDIそのものであることも突き止め、小胞体内の酸化還元環境に応じてEro1の酸化活性が厳密に制御されることとその分子機構の詳細を解明した。さらに新生鎖に対する各PDI family酵素のジスルフィド結合形成機構を試験管中で定量的に解析するため、ヒト無細胞合成系を用いた新生鎖の合成と、リボソーム―新生鎖複合体の調整を進め、本実験系を確立することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成２７年度は、小胞体内に送り込まれてくるLDLRの新生鎖にジスルフィド結合が導入される過程を観察するためのジスルフィド結合形成モニタリング系の開発に成功した。その結果、遅くともLDLRの新生鎖が約70kDaの大きさに伸長した時点でジスルフィド結合が導入されることが判明した。また、上記モニタリング系では近接したシステイン間に形成されたジスルフィド結合の検出が容易ではないことも判明した。この問題を解決するために、平成28年度への繰越金が発生したが、マレイミド基と6塩基からなる一本鎖DNA間に光で切断可能な反応基を導入したシステインの修飾試薬を開発した。この分子を利用することによって、新生鎖中に形成されたジスルフィド結合を鋭敏に検出できる新たな系の作製に成功した。これは技術的に大きな進展である。更に、質量分析によってLDLRと相互作用するPDIファミリータンパク質を網羅的に同定することにも成功した。
小胞体内のジスルフィド結合形成における最重要酵素であるEto1の溶液構造と活性制御機構の解明において大きな進展がみられ、近日中に論文投稿する準備が整った。さらに本研究課題の重要テーマの一つである、PDI familyによる新生鎖のジスルフィド結合形成機構の解明に向け、無細胞合成系を用いたリボソーム―新生鎖複合体の調整法の開発において大きな進展がみられ、平成２８年度以降の実験を加速的に遂行する下地が出来上がった。

Strategy for Future Research Activity

①リボソーム上で伸長しつつ小胞体内に送り込まれてきたLDLRの新生鎖にジスルフィド結合が形成される仕組みの解析
平成27年度、申請者らはジスルフィド結合形成モニタリング系の開発をすすめ、様々な工夫の結果、当初、予定していた系の構築に成功し、LDLRの新生鎖がリボソーム上で遅くとも約70kDaの大きさまで伸長した時にジスルフィド結合が導入されることを発見した。更に、LDLRと相互作用するPDIファミリータンパク質を網羅的に同定することにも成功した。平成28年度は、ノックダウン実験によって各PDIファミリータンパク質が、LDLRの酸化的な立体構造形成反応に果たす役割を解析する。また、ジスルフィド結合はLDLRのN末側のRドメインと中央部のEGFドメインに存在する。各ドメイン欠失体と上記のモニタリング系を組み合わせることによって、細胞内で新生鎖上にジスルフィド結合が導入される仕組みの詳細の解明を目指す。

②新生鎖のジスルフィド結合形成を試験管内で解析するための系の構築とそれを用いたジスルフィド結合形成メカニズムの解析
リボソーム―新生鎖複合体の調整法を確立できたため、次のステップはN末端から種々の長さに伸長した新生鎖の調整と各PDI familyを添加した際のジスルフィド結合形成モニタリングシステムの開発である。種々の長さの新生鎖調整のため、翻訳アレスト配列を幾つか特定の位置に挿入し、これにより意図した長さで翻訳が止まった新生鎖の調整に予備的に成功している。また、システインをマレイミドPEG修飾後に電気泳動することで、新生鎖のシステインの酸化還元状態が検出可能と思われる。以上の実験系を用い、PDI family酵素が新生鎖をどのように認識し、どのような作用機序のもとどのような効率でジスルフィド結合の導入・組換えを行うのか、定量的かつ分子構造レベルで詳細に解析する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Glasgow(United Kingdom)
  • Country Name: United Kingdom
  • Counterpart Institution: University of Glasgow
• [Journal Article] The membrane topology of Vitamin K Epoxide Reductase is conserved between human isoforms and the bacterial enzyme (2016)
  • Author(s): Cao, Z, van Lith, M., Mitchell, L. J., Pringle, M. A., Inaba, K. and Bulleid, N. J
  • Journal Title: Biochemical Journal Volume: 473 Pages: 851-858
  • DOI: 10.1042/BJ20151223
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cysteines 208 and 241 in Ero1α are required for maximal catalytic turnover (2016)
  • Author(s): Ramming, T, Kanemura, S., Okumura, M., Inaba, K.* and Appenzeller-Herzog, C.*
  • Journal Title: Redox Biology Volume: 7 Pages: 14-20
  • DOI: 10.1016/j.redox.2015.11.004.
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] One-dimensional sliding of p53 along DNA is accelerated in the presence of Ca2+ or Mg2+ at millimolar concentrations. (2015)
  • Author(s): Murata, A., Ito, Y., Kashima, R., Kanbayashi1, S., Nanatani, K., Igarashi, C., Okumura, M., Inaba, K., Tokino, T., Takahashi, S. and Kamagata, K.
  • Journal Title: J. Mol. Biol. Volume: 427 Pages: 2663-2678
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2015.06.016
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structural basis of a Ni acquisition cycle for [NiFe]-hydrogenase by HypA and its enhancer. (2015)
  • Author(s): Watanabe, S., Kawashima, T., Nishitani, Y., Kanai, T., Wada, T., Inaba, K., Atomi, H., Imanaka, T. and Miki, K.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 112 Pages: 7701-7706
  • DOI: 10.1073/pnas.1503102112
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A PDI-catalyzed thiol/disulfide switch regulates the production of hydrogen peroxide by human Ero1 (2015)
  • Author(s): Ramming, T., Okumura, M., Kanemura, S., Baday, S., Birk, J., Moes, S., Spiess, M., Jeno, P., Berneche, S., Inaba, K. and Appenzeller-Herzog, C.
  • Journal Title: Free Rad. Biol. Med. Volume: 83 Pages: 361-372
  • DOI: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.02.011
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The structures and functions of protein disulfide isomerase family members involved in proteostasis in the endoplasmic reticulum. (2015)
  • Author(s): Okumura, M., Kadokura, K. and Inaba, K.*
  • Journal Title: Free Rad. Biol. Med Volume: 83 Pages: 314-322
  • DOI: doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.02.010
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 新規PDIファミリータンパク質ERp46の構造と機能 (2015)
  • Author(s): 奥村 正樹、金村 進吾、稲葉 謙次
  • Journal Title: 日本生物物理学会会報誌 Volume: 55 Pages: 34-36
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 膵臓特異的に発現しているPDIファミリータンパク質(PDIp)の生理的な機能の解析 (2015)
  • Author(s): 藤本拓志、斎藤美知子、都留秋雄、松本雅記、河野憲二、稲葉謙次、門倉広
  • Organizer: 第38回 日本分子生物学会年会 第88回 日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] 高速AFMが明らかにしたPDIによる基質の酸化的フォールディング触媒機構の解明 (2015)
  • Author(s): 奥村 正樹、野井 健太郎、金村 進吾、秋山 修志、小椋 光、稲葉 謙次
  • Organizer: 第38回 日本分子生物学会年会 第88回 日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] PDI酸化酵素Ero1αのCys208-Cys241ジスルフィド結合の開裂を介した新規活性化機構 (2015)
  • Author(s): 金村 進吾、奥村 正樹、油谷 克英、Thomas Ramming、引間 孝明、Sefer Baday、 Simon Bernèche、秋山 修志、Christian Appenzeller-Herzog、稲葉 謙次
  • Organizer: 第38回 日本分子生物学会年会 第88回 日本生化学会大会 合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド（兵庫県神戸市）
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] Dynamic natures of PDI family members in catalysis of oxidative protein folding and ER associated degradation (2015)
  • Author(s): Inaba, K
  • Organizer: Symposium: From cytosol to ER; Translation, translocation and modification
  • Place of Presentation: 東北大学片平キャンパス（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-11-30
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Mechanisms of disulfide bond formation in nascent polypeptide chains in the ER of mammalian cells (2015)
  • Author(s): Kadokura, H
  • Organizer: Symposium: From cytosol to ER; Translation, translocation and modification
  • Place of Presentation: 東北大学片平キャンパス（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2015-11-30
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Preparations and Crystallizations of ER calcium storage protein Calsequestrin, its anchor protein Junctin and their complex (2015)
  • Author(s): Watanabe, A., Watanabe, S., Kanemura, S., Okumura, M., Inaba, K
  • Organizer: Campus Asia Symposium 2015
  • Place of Presentation: 上海、中国
  • Year and Date: 2015-11-04 – 2015-11-05
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Dynamic natures of PDI family member proteins that act on nascent chains in the endoplasmic reticulum (2015)
  • Author(s): Inaba, K
  • Organizer: Nascent chain biology meeting 2015
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂一条ホール（東京都文京区）
  • Year and Date: 2015-10-01
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Real-time monitoring of PDI-catalyzed oxidative protein folding by high-speed atomic force microscopy (2015)
  • Author(s): 奥村正樹、野井健太郎，金村進吾、増井翔史、引間孝明、秋山修志、小椋光、稲葉謙次
  • Organizer: 第53回 生物物理学会年会
  • Place of Presentation: 金沢大学角間キャンパス自然科学本館（石川県金沢市）
  • Year and Date: 2015-09-13 – 2015-09-15
  • Invited
• [Presentation] Dynamic natures of PDI family members in catalysis of oxidative protein folding and ER associated degradation (2015)
  • Author(s): Inaba, K
  • Organizer: EMBO meeting 2015
  • Place of Presentation: Birmingham, UK
  • Year and Date: 2015-09-05 – 2015-09-08
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamic natures of PDI family members in catalysis of oxidative protein folding and ER associated degradation (2015)
  • Author(s): Inaba, K
  • Organizer: Case Western Reserve University-Tohoku University joint symposium
  • Place of Presentation: Cleaveland, USA
  • Year and Date: 2015-07-29 – 2015-07-30
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] インスリンと相互作用するPDIファミリータンパク質の同定 (2015)
  • Author(s): 金谷健太郎、土屋雄一、河野憲二、稲葉謙次、門倉広
  • Organizer: 第67回 日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [Presentation] 膵特異的に発現するPDIファミリータンパク質(PDIp)の生理的機能の解析 (2015)
  • Author(s): 藤本拓志、斎藤美知子、都留秋雄、河野憲二、稲葉謙次、門倉広
  • Organizer: 第67回 日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: タワーホール船堀（東京都江戸川区）
  • Year and Date: 2015-06-30 – 2015-07-02
• [Presentation] 小胞体タンパク質品質管理に関わるERp44のpH依存的な構造ダイナミクス (2015)
  • Author(s): 渡部 聡、増井翔史、稲葉謙次
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] 高速AFM が明らかにするPDI による酸化的フォールディングの触媒機構 (2015)
  • Author(s): 奥村正樹、野井健太郎、金村進吾、増井翔史、引間孝明、秋山修志、小椋光、稲葉謙次
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] ヒト由来ジスルフィド結合形成酵素Ero1 αの新たな活性制御機構 (2015)
  • Author(s): 金村進吾、奥村正樹、油谷克英、Ramming, T.、引間孝明、Baday, S.、Berneche, S.、秋山修志、Appenzeller-Herzog, C.、稲葉謙次
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] 小胞体内のカルシウム貯蔵に関わる Calsequestrin とそのアンカータンハク質 Junctin の複合体の結晶化を目指した相互作用解析 (2015)
  • Author(s): 渡邊 あゆ美・渡部 聡・稲葉 謙次
  • Organizer: 第15回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: あわぎんホール（徳島県徳島市）
  • Year and Date: 2015-06-24 – 2015-06-26
• [Presentation] Dual conformations of ERdj5 play a significant role in acceleration of the ER associated degradation. (2015)
  • Author(s): Inaba, K.
  • Organizer: ER & Redox club meeting
  • Place of Presentation: Venice, Italy
  • Year and Date: 2015-04-15 – 2015-04-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Real-time monitoring of PDI-catalyzed oxidative protein folding by high-speed atomic force microscopy (2015)
  • Author(s): Okumura, M., Noi, K., Kanemura, S., Masui, S., Hikima, T., Akiyama, S., Ogura, T. and Inaba, K.
  • Organizer: ER & Redox club meeting
  • Place of Presentation: Venice, Italy
  • Year and Date: 2015-04-15 – 2015-04-17
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A newly identified disulfide bond in regulation of human Ero1α (2015)
  • Author(s): Kanemura, S., Okumura, M., Ramming, T., Baday, S., Bernèche, S., Appenzeller-Herzog, C. and Inaba, K.
  • Organizer: ER & Redox club meeting
  • Place of Presentation: Venice, Italy
  • Year and Date: 2015-04-15 – 2015-04-17
  • Int'l Joint Research
• [Remarks] 東北大学多元物質科学研究所 稲葉研究室
  • URL: http://www.tagen.tohoku.ac.jp/labo/inaba/
• [Remarks] 東北大学大学院生命科学研究科 | 稲葉謙次
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/t_inaba/
• [Remarks] 東北大学大学院生命科学研究科 | 門倉 広
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/h_kadokura/