新生鎖の立体構造形成を支えるジスルフィド形成システムの解明

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project Area: Nascent-chain Biology
• Project/Area Number: 26116005
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 稲葉 謙次 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (10423039)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 門倉 広 東北大学, 多元物質科学研究所, 准教授 (70224558)
• Project Period (FY): 2014-07-10 – 2019-03-31
• Keywords: タンパク質品質管理 / ジスルフィド結合 / Ｘ線結晶構造解析

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは、平成28年度には、平成27年度までに申請者らが開発することに成功したジスルフィド結合形成モニタリング系を利用した解析を推し進めた。その結果、1) 翻訳と共役しておこるLDL受容体(LDLR)の酸化的な立体構造形成反応は３つのフェーズに区分されること、2) そのうちの第１と第２のフェーズは、LDLRのN末側のドメインにジスルフィド結合が導入される反応にともなって観察されること、3) 第２のフェーズは、新生鎖が80kDaの大きさにまで伸長したときに誘起され、それまでにN末側のドメインに形成されていたジスルフィド結合が異性化され、当該ドメインが大きく構造変化することを見出した。これらの結果から、小胞体内におけるタンパク質の立体構造形成反応はリボソーム上での新生鎖の伸長反応と強く共役して段階的に進行しうることが明らかになった。また、P5がLDLRの立体構造形成に必要であることを示唆する知見も得た。
さらに、今高寛晃グループが開発したヒト細胞由来無細胞タンパク質合成システムを利用し、合成途上の新生鎖とリボソームの複合体を調整することに成功した。具体的には、分泌タンパク質の一つであるアルブミンを用い、翻訳アレストが起こるための配列を挿入することで、N末端から種々の長さまで翻訳伸長した安定なリボソーム―新生鎖複合体を系統的に作製した。ここに異なるPDIファミリー酵素を加え、ジスルフィド結合形成反応の経時変化を観測した。その結果、PDIやERp46などのPDIファミリー酵素がリボソーム―新生鎖複合体に対しても効率よくジスルフィド結合を導入するが、その反応機構はリボソームから解離した全長の基質に対するものとは明らかに異なることが判明した。高速AFMを用いた一分子観察により、PDIファミリー酵素が新生鎖にジスルフィド結合を導入する様子を捉えることにも成功しており、メカニズムに関する新しい知見も得られつつある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

タンパク質のジスルフィド結合形成は、新生鎖の合成、局在化、立体構造形成等とカップルし進行すると予想されるが、その実態は不明である。この反応を理解するために、申請者らは小胞体内に輸送された新生鎖にジスルフィド結合が形成される様子を観察するための系を開発した。本年度は、この系を利用して、新生鎖にジスルフィド結合が形成される仕組みの詳細を観察することに成功した。その結果、リボソーム上でのペプチドの伸長と強く共役して小胞体内におけるタンパク質のフォールディングが段階的に進行しうることが判明した 。また、下流のドメインが上流のドメインの立体構造形成を制御する場合があることを示唆する結果も得た。これらは、小胞体内におけるタンパク質の折り畳み機構を考える上で極めて重要な発見である。今後は、小胞体内におけるタンパク質の伸長とタンパク質の立体構造形成がどのようにカップルしているのかその分子機構を解明する。
もう一つの重要課題である新生鎖に対する各PDI family酵素の機能的役割と分子機構の解明についても、すでに試験管中でのリボソーム―新生鎖複合体の系統的作製に成功し、定量的解析を行うことで、各PDI family酵素の新生鎖に対するジスルフィド結合導入効率とその反応機構に関するいくつもの興味深い知見が得られている。また高速AFMを用いた一分子観察により、PDIファミリー酵素が新生鎖にジスルフィド結合を導入する様子を捉えることにも成功しており、新生鎖と各PDI family酵素間の反応を一分子レベルで解析する下地は出来上がった。今後、我々が得意とする構造生物学的手法を駆使し、PDI family酵素と新生鎖間の分子認識機構および作用機序に関する解析を加速的に進める。

Strategy for Future Research Activity

以下の実験によって、新生鎖の翻訳合成とジスルフィド結合形成反応がどのように共役して進行するのかを細胞レベルおよび分子構造レベルで解明する。
①申請者らはLDLRの新生鎖が約80kDaの大きさに伸長するとN末側のドメインに導入されたジスルフィド結合が異性化され、当該ドメインの構造が大きく変化することを見出した。この発見は下流の配列の翻訳が上流のドメインの構造形成を制御し得ることを意味し興味深い。本年度は、その仕組みを解明するため、LDLRの様々な欠失変異とジスルフィド結合形成モニタリング系を利用した解析をすすめ、LDLRの翻訳合成と新生鎖の立体構造形成の共役機構を解明する。
②C7抗体はLDLRのN末端ドメインに天然型のジスルフィド結合が形成されて初めてLDLRを認識する。この抗体を利用した解析により、80kDaで誘起される先述のジスルフィド結合異性化反応が、LDLRの折りたたみ経路上どのような意義を持つのかを明らかにする。
③N末端からの長さの異なる新生鎖―リボソーム複合体を系統的に作製し、またそれと反応させるPDI family酵素の種類を増やし、より多くのバリエーションで反応を解析することで、各論的新しい知見と普遍的概念の両方を導き出す。
④高速AFMによる一分子観察とX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡解析を駆使し、PSI family酵素の新生鎖に対する分子認識と作用機構を分子構造レベルで明らかにする。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Basel(Switzerland)
  • Country Name: Switzerland
  • Counterpart Institution: University of Basel
• [Int'l Joint Research] University of Glasgow(United Kingdom)
  • Country Name: United Kingdom
  • Counterpart Institution: University of Glasgow
• [Journal Article] Structural basis of pH-dependent client binding by ERp44, a key regulator of protein secretion at the ER-Golgi interface (2017)
  • Author(s): Watanabe, S., Harayama, M., Kanemura, S., Sitia, R. and Inaba, K.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci USA Volume: 114 Pages: 3224-3232
  • DOI: 10.1073/pnas.1621426114
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Preparation of selenoinsulin as a long-lasting insulin analog (2017)
  • Author(s): Arai, K., Takei, T., Okumura, M., Watanabe, S. Amagai, Y., Asahina, Y., Moroder, L., Hojo, H., Inaba, K. and Iwaoka, M.
  • Journal Title: Angewandte Chemie Int. Ed. Volume: 56 Pages: 5522-5526
  • DOI: 10.1002/anie.201701654
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] The highly dynamic nature of ERdj5 is key to efficient elimination of aberrant protein oligomers through ER-associated degradation (2017)
  • Author(s): Maegawa, K., Watanabe, S., Noi, K., Okumura, M., Amagai, Y., Inoue, M., Ushioda, R., Nagata, K., Ogura, T. and Inaba, K.*
  • Journal Title: Structure Volume: in press Pages: 未定
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Redox-assisted regulation of Ca2+ homeostasis in the endoplasmic reticulum by disulfide reductase ERdj5. (2016)
  • Author(s): Ushioda R, Miyamoto A, Inoue M, Watanabe S, Okumura M, Maegawa KI, Uegaki K, Fujii S, Fukuda Y, Umitsu M, Takagi J, Inaba K., Mikoshiba K, Nagata K.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A. Volume: 113 Pages: 6055-6063
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Human ER oxidoreductin-1a undergoes dual regulation through complementary redox interactions with protein-disulfide isomerase (2016)
  • Author(s): Kanemura, S., Okumura, M., Yutani, K., Ramming, T., Hikima, T., Appenzeller-Herzog, C. , Akiyama, S. and Inaba, K.*
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 291 Pages: 23952-23964
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 哺乳動物細胞小胞体内におけるLDL受容体新生ポリペプチド鎖の酸化的フォールディング機構の解析 (2017)
  • Author(s): 太宰 結、中村織江、稲葉謙次、門倉 広
  • Organizer: 日本農芸化学会2017年度大会
  • Place of Presentation: 京都女子大学（京都府京都市）
  • Year and Date: 2017-03-17 – 2017-03-20
• [Presentation] Zn-dependent regulation of the protein quality control by ERp44 in the early secretory pathway (2016)
  • Author(s): Harayama, M., Watanabe, S., Amagai, Y., Sannino, S., Sitia, R., Inaba, K
  • Organizer: 第39回分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] PDIとのレドックス相互作用を介したEro1aの二重の酸化活性制御機構 (2016)
  • Author(s): 金村 進吾, 奥村 正樹, 油谷 克英, Thomas Ramming, 引間 孝明, Christian Appenzeller-Herzog, 秋山 修志, 稲葉 謙次
  • Organizer: 第39回分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 酸化的フォールディングの触媒過程にみられるPDIの動的な結合・解離 (2016)
  • Author(s): 奥村 正樹, 野井 健太郎, 金村 進吾, 引間 孝明, 秋山 修志, 小椋 光, 稲葉 謙次
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 小胞体カルシウムポンプSERCA2bの活性制御機構の解析 (2016)
  • Author(s): 柳澤孝俊, 井上道雄, 作田菜奈美, 潮田亮, 永田和宏, 稲葉謙次
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] ERdj5とBiPの共役による酸化的フォールディング触媒機構の解明 (2016)
  • Author(s): 大村 圭一, 奥村 正樹, 前川 憲一, 金村 進吾, 井上 道雄, 潮田 亮, 永田 和宏, 稲葉 謙次
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 哺乳動物細胞小胞体におけるLDLレセプター新生ポリペプチド鎖の酸化的フォールディング機構 (2016)
  • Author(s): 太宰 結、稲葉謙次、門倉 広
  • Organizer: 第39回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
  • Year and Date: 2016-11-30 – 2016-12-02
• [Presentation] 分泌タンパク質の品質管理に関与する ERp44 の pH と亜鉛イオンによる機能制御の構造基盤 (2016)
  • Author(s): 渡部 聡,原山麻奈美,天貝佑太,増井翔史,金村進吾,SaraSannino, Roberto Sitia, 稲葉謙次
  • Organizer: 平成28年度 日本結晶学会年会
  • Place of Presentation: 茨城県立県民文化センター（茨城県水戸市）
  • Year and Date: 2016-11-17 – 2016-11-18
• [Presentation] Dynamic assembly/disassembly of Protein Disulfide Isomerase during the catalysis of oxidative protein folding. (2016)
  • Author(s): Okumura, M., Noi, K., Kanemura, S., Hikima, T., Akiyama, S., Ogura, T., Inaba, K
  • Organizer: EMBO Meeting 2016
  • Place of Presentation: Girona, Spain
  • Year and Date: 2016-10-23 – 2016-10-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Dual regulation of human Ero1 via redox interplays with PDI (2016)
  • Author(s): Kanemura, S., Okumura, M., Yutani, K., Ramming, T., Appenzeller-Herzog, C. Akiyama, S., Inaba, K
  • Organizer: EMBO Meeting 2016
  • Place of Presentation: Girona, Spain
  • Year and Date: 2016-10-23 – 2016-10-27
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 小胞体タンパク質品質管理に関与するERp44のpHと亜鉛イオンによる機能制御 (2016)
  • Author(s): 渡部 聡, 原山麻奈美, 天貝佑太, 増井翔史, Sara Sannino, Roberto Sitia, 稲葉謙次
  • Organizer: 第８９回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] 膵特異的に発現しているPDIファミリータンパク質(PDIp)の生理的な機能の解析 (2016)
  • Author(s): 藤本拓志、斎藤美知子、都留秋雄、松本雅記、河野憲二、稲葉謙次、門倉 広
  • Organizer: 第８９回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 仙台国際センター 東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
  • Year and Date: 2016-09-25 – 2016-09-27
• [Presentation] How do PDI family member proteins act on unfolded/misfolded proteins to ensure protein quality control in the early secretory pathway? (2016)
  • Author(s): Inaba, K
  • Organizer: Nascent chain biology meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Observing disulfide bond formation in a cell surface protein as the polypeptide chain elongates from the ribosome in mammalian cells (2016)
  • Author(s): Kadokura, H
  • Organizer: Nascent chain biology meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Dynamic assembly/disassembly of Protein Disulfide Isomerase during the catalysis of oxidative protein folding (2016)
  • Author(s): Okumura, M., Noi, K., Kanemura, S., Hikima, T., Akiyama, S., Ogura, T., Inaba, K
  • Organizer: Nascent chain biology meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Human Ero1 undergoes dual regulation via redox interplays with PDI (2016)
  • Author(s): Kanemura, S., Okumura, M., Yutani, K., Ramming, T., Appenzeller-Herzog, C. Akiyama, S., Inaba, K
  • Organizer: Nascent chain biology meeting 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Structural basis of pH- and zinc-dependent protein quality control by ERp44 (2016)
  • Author(s): Watanabe, S., Harayama, M., Amagai, Y., Sannino, S. Masui, S., Sitia, R. and Inaba, K.
  • Organizer: Nascent Chain Biology 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Physiological function of pancreas-specific PDI family protein (PDIp) (2016)
  • Author(s): Fujimoto, T., Saito, M., Tsuru, A., Matsumoto, M., Kohno, K., Inaba, K. and Kadokura, H.
  • Organizer: Nascent Chain Biology 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Mechanisms of oxidative folding of newly-synthesized LDL receptor in the ER of mammalian cells (2016)
  • Author(s): Dazai, Y., Inaba, K. and Kadokura, H.
  • Organizer: Nascent Chain Biology 2016
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 酸化的フォールディングを支えるPDIファミリー酵素の新規触媒機構の解明 (2016)
  • Author(s): 奥村正樹, 野井健太郎, 金村進吾, 引間孝明, 秋山修志, 小椋光, 稲葉謙次
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07 – 2016-06-09
  • Invited
• [Presentation] 哺乳動物分泌蛋白質の新生鎖上にジスルフィド結合を形成する仕組み (2016)
  • Author(s): 門倉 広、稲葉謙次
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07 – 2016-06-09
  • Invited
• [Presentation] 膵特異的に発現しているPDIファミリータンパク質(PDIp)の生理的な基質の同定 (2016)
  • Author(s): 藤本拓志、斎藤美知子、都留秋雄、松本雅記、河野憲二、稲葉謙次、門倉広
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [Presentation] 亜鉛イオンによるERp44を介した小胞体タンパク質品質管理機構の分子基盤 (2016)
  • Author(s): 渡部 聡, 原山麻奈美, 天貝佑太, 増井翔史, Sara Sannino, Roberto Sitia, 稲葉謙次
  • Organizer: 第１６回日本蛋白質科学会年会
  • Place of Presentation: 福岡国際会議場（福岡県福岡市）
  • Year and Date: 2016-06-07 – 2016-06-09
• [Remarks] 東北大学多元物質科学研究所 稲葉研究室
  • URL: http://www.tagen.tohoku.ac.jp/labo/inaba/
• [Remarks] 東北大学大学院生命科学研究科 | 稲葉謙次
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/t_inaba/
• [Remarks] 東北大学大学院生命科学研究科 | 門倉 広
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/h_kadokura/
• [Remarks] 新規人工インスリン「セレノインスリン」の化学合成と機能解明に成功
  • URL: http://www2.tagen.tohoku.ac.jp/lab/news_press/20170411/
• [Funded Workshop] Nascent Chain Biology Meeting 2016 (2016)
  • Place of Presentation: 富士レークホテル（山梨県富士河口湖町）
  • Year and Date: 2016-09-01 – 2016-09-03