1989 Fiscal Year Annual Research Report
TRH欠損症における人proTRHcDNA塩基配列異常の研究
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01480284
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
森 昌朋 群馬大学, 医学部, 講師 (80174382)
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| Keywords | proTRH / proTRHcDNA / mRNA / PCR / 視床下部 |
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| Research Abstract |
ラットproTRHcDNAのamplification
ラットproTRHcDNAの5端+1〜17のsense並びにproTRHをencodeしているexon5の3'端antisense(T_7promtorを付加し、かつEcoRI〔G GAATTCC〕並びにHindIII認識塩基linker〔CAAGCTTG〕を付加している)を用い、Mg^<++>0.2mM,annealing温度56℃のlow stringencyでTaq polymeraseを使用するPCRを30cycles行い、ラットproTRHcDNAをamplifyした。その後EcoRI並びにHindIIIのrestriction enzymeを使用し、上記のamplifsedCDNAを切断後、SP65vectorへinsertした。その後、T_7RNA polymeraseを用いて^<32>P-proTRHcRNAを作製した。ラットを甲状腺摘出し2週間後にT_47.5μg/100g体重を腹腔内投与後、経時的に断頭屠殺し、前視床下部をguanidium-thiocyanate,lithium chloride,phenol,ethanol沈澱法を用い、全RNAを抽出した。1%agarose gel電気泳動を行い、ナイロンフィルタ-にblottingした後、上記にて得られた^<32>P-proTRHcRNAを用いてNorthern blot解折を行った。ラットproTRHmRNAは1.2Kbpの位置に検出された。このNorthern blotをデンシトメ-タ-により測定すると、正常全視床下部TRHmRNAは23.3±3.4AU(N=7)であり、甲状腺摘出2週間後には43.8±5.3AU(N=13)へと著明に増加し、T_4投与3時間後には、27.3±2.9AU(N=7)へと減少し、投与24時間後には12.0±2.3AU(N=7)へと正常よりむしろ減少した。これらの成績はproTRHcDNAはPCR法により確実にamplifyされた事を示しており、かつラット前視床下部でのproTRH gene expression研究にも応用可能である事を示している。
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