DNAプロ-ベによる胎児の風疹ウイルス感染診断法の確立

1989 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 01571274
• Research Institution: 国立予防衛生研究所
• Principal Investigator: 加藤 茂孝 国立予防衛生研究所, 麻疹ウイルス部, 主任研究官 (20211162)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 棚林 清 国立予防衛生研究所, 麻疹ウイルス部, 研究員 (50197505) ; 竹内 薫 国立予防衛生研究所, 麻疹ウイルス部, 研究員 (00192162) ; 川名 尚 東京大学, 医学部・付属病院分院・産婦人科, 教授 (90010272)
• Keywords: 風疹ウイルス / ウイルスゲノム / DNAプロ-ベ / 胎児診断 / ゲノム診断 / PCR / 先天性風疹 / 妊娠

Research Abstract

1.風疹ウイルスゲノムRNAからの相補的DNA(cDNA)の作成
(1)抽出ウイルスRNA。増幅cDNAで判定して、7ケの部位の内、6ケで作成可能であった。
(2)ウイルス粒子RNA。ウイルス粒子をSDSで可溶化したRNAで作成可能になった。
(3)ウイルス感染細胞RNA。感染細胞を加熱破壊し、可溶化したRNAで作成可能であった。
2.cNDAのPCRによる増幅
(1)プラスミドDNA。7ケの部位の内、6ケで増幅可能であった。
(2)ウイルスRNAより作成したcDNA。7ケの部位の内、6ケで増幅可能であった。プラスミドDNAに比べて、非特異的なDNAバンドの増幅が多かった。これは、ウイルス以外の細胞由来のDNAやcDNAによるものと思われた。
3.マイクロプレ-トでの酵素反応による増幅されたcDNAの検出
(1)ビオチン化DNAプロ-ベの作成。増幅したcDNAを検出するプロ-ベとして、ビチオン化DNAをPCRで作成した。試みた3ケの部位で、全て効率よく作成された。
(2)検出条件の検討。マイクロプレ-トに増幅したcDNAを吸着させ、このcDNAにハイブリダイズしたDNAプロ-ベ上のビオチンに対して特異的に結合するストレプトアビジンで標識したペルオキシダ-ゼを作用させ、結合したペルオキシダ-ゼの酵素反応により、cDNAを検出した。DNAの希釈濃度を検討した。
(3)検出の特異性。風疹ウイルスRNAのcDNAの特定部位以外は他のいかなる種類のDNA、cDNAともハイブリダイズせず、極めて特異性が高いものと思われた。