1992 Fiscal Year Annual Research Report
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02454247
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| Research Institution | KYUSYU UNIVERSITY |
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Principal Investigator |
鈴木 友和 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (20028517)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
阿部 眞佐子 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (30222665)
真下 昌己 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (80159144)
鈴木 康代 九州大学, 生体防御医学研究所, 助手 (90226564)
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| Keywords | HHH症候群 / 尿素サイクル / ミトコンドリア / オルニチン転送蛋白 / オルニチン転送蛋白cDNA / ミックスドプライマー |
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| Research Abstract |
HHH症候群の病因を明らかにするため、その原因タンパク質と考えられている肝細胞ミトコンドリア内膜のオルニチン転送体を単離し、さらにその一次構造に基づきcDNAの単離を進めた。
まず最近報告されたPalmieriらの方法に準じ、ラットのミトコンドリアからジギトニンを用いてマイトプラストを分離し、それをトライトンX-100で可溶化し超遠心にかけた。上清画分にカルジオリピンを添加して、ハイドロキシアパタイトカラムにかけ、素通り画分を得た。これをDEAE-Sephacelにかけて、カルジオリピンと燐酸ナトリウムで溶出させた。この画分のSDSポリアクリルアミド電気泳動により、二本のバンドが得られ、分子量33,500のバンドをPVDF膜にエレクトロブロットしてアミノ酸のN末端の一次構造を決定した。その結果、3ヶ所末決定であるが12残基のアミノ酸配列が得られた。このGlu-Ala-Leu-Lys or Thr-Ala-Gln or Glu-Ala-Leu-Lys-Asp-Phe-Asn or Thrの配列からミックスドプライマーを合成した。このプライマーとオリゴdTを対にして、ラットの肝臓のcDNAを鋳型として、PCRを行った。ミックスドプライマーORT1用いた場合約880bpのバンドが現れた。このDNA断片の配列を決定したところ、ORT1を両端のプライマーとして持ち、読み枠が異なっていた。このような非特異的なバンドを減らすためにλgt10に組み込んだラット肝臓cDNAライブラリーを鋳型とし、λgt10に特異的なプライマーとミックスドプライマーを用いてPCRを行ったところ、約1kbのバンドが得られた。このバンドの配列を決定したが、ミックスドプライマーに続く配列がアミノ酸配列により推定されるものと異なっていた。現在、ミックスドプライマーの内部プライマーにより、PCR産物を検索中である。
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