ギャップ結合蛋白質アミノ酸配列の特定部位のモノクロ-ナル抗体による機能の研究

1990 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 02670038
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 廣野 力 広島大学, 歯学部, 助手 (10199135)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴 芳樹 広島大学, 歯学部, 助教授 (90110452)
• Keywords: ギャップ結合 / コネクシン / モノクロ-ナル抗体 / 細胞間連絡 / 肝細胞 / 培養細胞

Research Abstract

本年度の研究実施計画に従いラット肝臓ギャップ結合蛋白質の一部分であるペプチドに対するモノクロ-ナル抗体作成の研究を行った。さらに来年度実施予定研究の予備実験も行い,以下の研究実績を上げた。
1.ラット肝臓ギャップ結合蛋白コネクシン26及びコネクシン32のチャネル開口部に近い細胞質ル-プ中のアミノ酸18個分のペプチドを業者に委託して合成した。
2.これらの合成ペプチドをアルブミンに結合させたものを抗原としてマウスを免疫し,脾臓細胞とミエロ-マ細胞をポリエチレングリコ-ルで融合させた。融合により増殖性のあるハイブリド-マが多数得られ,一部を購入した凍結保存容器に入れ保存した。
3.現在,抗体を産生する細胞をELISA法で選別しつつある。
4.モノクロ-ナル抗体に比べて短期間で作成できるポリクロ-ナル抗体もウサギで作成し免疫組織化学的性質を調べた。コネクシン26ペプチドに対するウサギ抗血清は1000倍希釈でマウス肝臓凍結切片を染色した。
5.来年度実施予定の抗体注入の予備実験としてラット肝細胞の初代培養を行い,蛍光色素法により細胞間連絡を測定した。細胞分離後,通常の培養条件では細胞間連絡は急速に低下したので,現在細胞間連絡維持のための条件を検討中である。
6.肝蔵由来の上皮系培養細胞BRL,ARLJ301ー3,RLCー16を培養し,細胞間連絡を測定した。単層培養に近い状態まで増殖した場合,BRL,ARLJ301ー3では細胞間連絡がよく発達していた。イムノブロッティングを行う準備として,これらの培養細胞を大量培養し,水酸化ナトリウム処理後,購入したアングルロ-タを用いた遠心操作によりアルカリ不溶性分画を作成した。

Research Products

• [Publications] Hirono,C: "Monoclonal antibodies against gap junction protein from rat liver." The Japanese Journal of Physiology. 40. S15-S15 (1990)
• [Publications] Shiba,Y: "Inhibition of gapーjunctional intercellular communicatior and enhanced binding of fibronectinーcoated latex beads by stimulation of DNA synthesis in quiescent 3T3ーL1 cells." Journal of Cellular Physiology. 145. 268-273 (1990)