ストレスにより誘導されるメタロチオネインを指標としたストレスの客観的評価法の開発

1991 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03557028
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小島 豊 北海道大学, 大学院・環境科学研究科, 教授 (50135555)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西野 幸典 同志社女子大学, 家政学部, 教授 (20093289) ; 蔵崎 正明 北海道大学, 大学院・環境科学研究科, 助手 (80161727) ; 新岡 正 北海道大学, 大学院・環境科学研究科, 助手 (20123953)
• Keywords: ストレス / メタロチオネイン / メタロチオネイン遺伝子 / メタロチオネイン抗体 / モノクロナル抗体 / 大腸菌での発現 / ヒト・メタロチオネインII / ストレスの評価

Research Abstract

種々の身体的・心理的ストレスによって,メタロチオネイン(重金属結合低分子量蛋白質)が誘導・生合成され,肝・血液・尿中のメタロチオネイン量が増加することが知られてきた。
本研究は,このストレスの際誘導される蛋白質(メタロチオネイン)を利用し,ストレスの客観的評価法を確立することを目的としている。すなわち,遺伝子工学的手法で大量に得られたヒト・メタロチオネインを抗原として,モノクロナル抗体を調製し,それを用いて,ストレス状態の際の尿・血中のメタロチオネイン量を測定し,ヒトのストレスを他覚的に評価する方法を確立する。
当該年度の実績は次の如くである。
1.ヒト・メタロチオネイン遺伝子の実現
メタロチオネインの遺伝子を全く持たない大腸菌に,ヒト・メタロチオネインIIの遺伝子を導入し,発現させることに成功した。
2.ヒト・メタロチオネインIIの大量精製
1.で得られた大腸菌を大量培養し,その菌体破砕液を出発材料として,ゲル濾過,高速液体クロマトグラフィ-等により,ヒト・メタロチオネインIIを大量に精製した。
3.ヒト・メタロチオネインIIのモノクロナル免疫抗体の調製
2.で得られたヒト・メタロチオネインIIを抗原として,マウスに注射し,抗体をつくらせた。ヒト・メタロチオネイン抗体を産生しているマウス脾臓由来のB細胞と,マウス・ミエロ-マ細胞を融合させ,抗体を産生するハイブリド-マのクロ-ニングを行った。これらの実験に,本研究費で購入したELISA法装置が大変役に立っている。今後ハイブリオド-マの培養上清より,また同細胞をマウス腹腔内に移植し,その腹水より抗体を調節する予定である。

Research Products

• [Publications] YUTAKA KOJIMA: "Definition and Nomenclature of Metallothioneins" Methods in Enzymology,ACAMEMIC PRESS,INC. 205. 8-10 (1991)
• [Publications] YUTAKA KOJIMA and PETER E.HUNZIKER: "Amino Acid Analysis of Metallothionein" Methods in Enzymology,ACAMEMIC PRESS,INC. 205. 419-421 (1991)
• [Publications] 及川 伸二,Ana Rosa LINDES ARIAS,江本 匡,蔵崎 正明,小田原 史知,蔵崎 美佳,山崎 太,小島 豊: "システイン→アラニン置換人工メタロチオネインの大腸菌内での発現" 日本衛生学雑誌. 47. 199- (1992)
• [Publications] 江本 匡,及川 伸二,小田原 史知,蔵崎 美佳,Ana Rosa LINDES ARIAS,山崎 太,小島 豊,蔵崎 正明,Elaine A,Mackay,J.H.R.Kogi: "大腸菌で発現させたセリン→ロイシン、イソロイシン置換人工メタロチオネイン" 日本衛生学雑誌. 47. 200- (1992)
• [Publications] Curlis D,Klaassen and Kazuo T,Suzuki: "Studies on Induction of Zinc Metallothionein by Sensory and Psychological Stresses in Rat Liver;Melallothionein in Biology and Medicine" CRC Press, 414 (1991)