ストレスにより誘導されるメタロチオネイン指標としたストレスの客観的評価法の開発

1992 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 03557028
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 小島 豊 北海道大学, 大学院・環境科学研究科, 教授 (50135555)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西野 幸典 同志社女子大学, 家政学部, 教授 (20093289) ; 蔵崎 正明 北海道大学, 大学院環境科学研究科, 助手 (80161727) ; 新岡 正 北海道大学, 大学院環境科学研究科, 助手 (20123953)
• Keywords: ストレス / メタロチオネイン / メタロチオネイン遺伝子 / メタロチオネイン抗体 / モノクロナル抗体 / 大腸菌での発現 / ヒト・メタロチオネインII / ストレスの評価

Research Abstract

種々の身体的・心理的ストレスによって,メタロチオネイン(重金属結合低分子量蛋白質)が誘導・生合成され,肝・血液・尿中のメタロチオネイン量の増加することが知られてきた。
本研究は,このストレスの際誘導される蛋白質(メタロチオネイン)を利用し,ストレスの客観的評価法を確立することを目的としている。すなわち,遺伝子工学的手法で大量に得られたヒト・メタロチオネインを抗原として,モノクロナル抗体を調製し,それを用いて,ストレス状態の際の尿・血中のメタロチオネイン量を測定し、ヒトのストレスを他覚的に評価する方法を確立する。
当該年度の実績は次の如くである。
1.大腸菌を用いたヒト・メタロチオネインの大量精製
メタロチオネインの遺伝子を全く持たない大腸菌に,ヒト・メタロチオネインIIの遺伝子を導入し、その大腸菌を大量培養した。菌体破砕液よりゲル濾過,高速液体クロマトグラファー等により、ヒト・メタロチオネインIIを大量に調製した。
2.ヒト・メタロチオネインIIのモノクロナル免疫抗体の調製
1.で得られたヒト・メタロチオネインIIを抗原として,マウスに注射し,抗体をつくらせた。ヒト・メタロチオネイン抗体を産生しているマウス脾臓由来のB細胞と,マウス・ミエローマ細胞を融合させ,抗体を産生するハイブリドーマのクローニングを行った。ハイブリドーマの培養上消より、また同細胞をマウス腹腔内に移植し,その腹水より杭体を調製した。
今後,この抗体を用い,ELISA法とラジオイミコノ・アッセイの確立に努力している。これが確立すれば,ストレスに曝露された物動の生体試料中のメタロチオネインの定量を行う。

Research Products

• [Publications] Shinji Oikawa,Masaaki Kurasaki,Fumitomo Odawara,Mika Kurasaki,Tadasu Emolo&Yutaka Kojima: "Expression of Amino Acid Substituted rluman Metallo-thionein-2 By Site-disected Mutagenesis in Escherichea coli" 3rd Onterantional Meeting on Metallothionein,Abstracts. 35-35 (1992)
• [Publications] Tadasu Emoto,Sinji Oikawa,Masaaki Kurasaki,Ana Rosa Linde Arias,&Yutaka Kojima: "Serine to Leucine Substituted Metallothionein by Site-directed Mutagenesis Expressed in Echerichia coli and its mital-binding properties" 3rd International Meeting on Melallothione in,Abstracts. 36-36 (1992)