1992 Fiscal Year Annual Research Report
非アイソトープ標識プローブの調製法の検討とDNA解析への適用
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04670362
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
篠塚 達雄 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (70095610)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
原 正昭 埼玉医科大学, 助手 (50129160)
柳田 純一 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (70049790)
広瀬 忠明 慶應義塾大学, 医学部, 講師 (60051405)
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| Keywords | DNA多型 / PCR法 / RFLP法 / HLADQα / 親子鑑定 |
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| Research Abstract |
親子鑑定でのHLA検査後に凍結保存しておいたリンパ球で、非アイソトープ標識プローブを用いたRFLP法によるDNA解析が可能かどうかについて検討した。一般にDNAの抽出目的には、EDTAを用いた採血が適しているとされるが、HLA検査はヘパリン加血を用いている。そこでEDTA加血とヘパリン加血の試料からそれぞれDNAの抽出を行ない、DNAの回収率と純度について調べたところ、ヘパリン加血とEDTA加血共にリンパ球からのDNA回収量に差が認められなかった。ついでリンパ球からのDNA抽出法を種々(塩析法、フェノール・クロロホルム法、フェノール・クロロホルム変法)検討したところ、フェノール・クロロホルム変法による抽出がDNAの回収量およびDNAの純度の点で優れていることが分かった。この方法を用いて親子鑑定例におけるHLA検査後の残りのリンパ球からDNAを抽出し、PCR法によるHLADQαタイピングを行なったところ、充分に検出可能であることが明かになった(DNA多型研究会において発表,1992)。
10家系の親子鑑定におけるHLA検査後のリンパ球試料からのDNAを使用し、市販の非アイソトープ(ギゴキシゲニン)標識MZ1.3プローブによるRELP法を試みたところ、6家系の試料でDNAフィンガープリンティングを行なうことが可能であり、4家系の試料では明確な判定が出来なかった。この方法でのDNA検出限界を検討したところ、アガロース電気泳動で1レーン当り約10μgのDNA量が必要であり、検出感度は十分なものではなかった。10家系のDNA試料をPCR法での解析に適用したところ、HLADQαタイピングもD1S80分析も充分に解析が可能であった。
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