HOMOLOGOUS RECOMBINATIONを応用した脱白血病化の研究

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05404040
• Research Institution: NIIGATA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 柴田 昭 新潟大学, 医学部, 教授 (10004772)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岸 賢治 新潟大学, 医学部・附属病院, 助手 (30186209) ; 小池 正 新潟大学, 医学部・附属病院, 助手 (30170161) ; 高橋 益広 新潟大学, 医学部, 助手 (90179531)
• Keywords: homologous recombination / 脱白血病化 / 遺伝子治療 / pGD210 / TK / ganciclovir

Research Abstract

Homologous recombinationを応用した脱白血病化の研究は、白血病の遺伝子治療を確立する上に重要である。我々は、マウス血液細胞株を用いて、homologous recombination法を応用して遺伝子導入を行うことにより、あらかじめ導入されているBCR-ABLをつぶすためのプラスミッドを作成し、そのプラスミッドについての予備的検討を行ったので報告する。【方法】homologous recombination用のプラスミッドpGDTKbcrNeoablreverseは、pGD210(Dr.Martin L.Scottより供与を受けた)を基本に、pSHTから切り出したTKを組込み、BCR-ABLの間にpMC1NeoPolyAより切り出したNeoを組み込んだBCR-Neo-ABLをhomologous部位(BCR-ABL領域)の特異性を高めるために逆向きに挿入し直すことにより作成した。遺伝子導入標的細胞としてIL-3依存性マウス骨髄細胞株FDC-P2を用い、遺伝子導入は矩形波による電気パルス法で行った。遺伝子導入細胞の選択は、導入したプラスミッドの構造により、G418添加培養、またはIL-3を加えない培養で行った。導入遺伝子発現の確認は、BCR-ABL、Neo、TKについて、PCRおよびRT-PCRにより行い、導入遺伝子のコピー数は、FISH法にて判定した。【結果】FDC-P2にBCR-ABL遺伝子を導入することにより自律増殖能の獲得が認められ、すべてのクローンにおいて、1コピーの遺伝子が導入されていた。FDC-P2にpGDTKbcrNeoablreverseを導入することにより、Neo、TKの発現が認められ、G418に耐性となり、かつgancyclovirに対する感受性が亢進したクローンが得られた。これらのクローンには自律増殖能の獲得は認められなかった。【結論】BCR-ABL遺伝子を導入して、自律増殖能を獲得したFDC-P2にpGDTKbcr Neoablreverseを導入することにより、homologous recombinationによる組込みがおこれば、BCR-ABLをつぶすことができかつそれをG418とgancycloviruで選択できる可能性が示唆された。

Research Products

• [Publications] Furukawa T.et al: "Establishment of a new cell line with the characteristics" Leukemia. 8. 171-180 (1994)
• [Publications] Koike T.et al: "The therapeutic significance of mycloperoxidase" Leukemia. 8. 1253-1255 (1994)
• [Publications] Takahashi M.et al: "Transfection of the bcrlabloncogene into factor" Hematol Oncol. 12. 53-60 (1994)