DNA多型による親子鑑定のためのゲル内競合的再会合法

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05557031
• Research Institution: 大分医科大学
• Principal Investigator: 玉置 嘉広 大分医科大学, 医学部, 教授 (20028377)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 福田 昌子 大分医科大学, 医学部, 助手 (00156788) ; 岸田 哲子 大分医科大学, 医学部, 助教授 (50136793) ; 万年 和明 大分医科大学, 医学部, 助教授 (20145361)
• Keywords: DNA多型 / 親子鑑定 / サブトラクション / ゲル内競合的再会合法

Research Abstract

高価なDNAフィンガープリント・プローブを使用せずに親子鑑定を行う一方法として、子供のDNA断片を父とされる男性及び母親の過剰のDNA断片でサブトラクトすることによって父子関係の存否を判定しようと試みた。先ず血液型及びDNAフィンガープリントで被検者トリオの親子関係を確認して、そのトリオの白血球からDNAを抽出し、EcoRIで消化した。血縁関係のない男性のDNAも同様に処理した。子供のDNAの3'末端をfill-inによってビオチン標識し、母及び父又は無関係の男性の過剰のDNAと混合してアガロース電気泳動し、アルカリ変性後、再会合液中で競合的に再会合させることによってサブトラクションを行った。ゲルから1〜2kbの断片を抽出してアンカーを付加した後、これをPCR増幅した。増幅混合物中の子供のDNA断片を固相化ストレプタビジンで捕捉し、再PCR増幅後、ドット・ブロット法で検出した。
サブトラクションの結果、父子関係の存在しない場合のみ子供のDNA断片の一部が取り残され、それがPCR増幅によって検出されるはずであった。しかし実際には父子関係の有無にかかわらず子供のDNAが増幅され検出された。いろいろと条件を変えて実験を行ったが、結果は同じであった。技術的困難の原因はDNA断片の過多・過密にあるかもしれない。そこで、以下のような方法を検討している。(1)個人特徴的な縦列反復配列断片の少ない高分子領域をゲルから抽出して両親のDNA断片の方を標識し、これで子供の断片をサブトラクした後、上清に残るはずの子供の断片を増幅して検出する。(2)ハイブリッド形成法により選抜した子供の縦列反復配列のみをサブトラクションの対象にする。(3)Alu-PCR,Kpn-PCR等によってゲノムから選抜したDNA断片間でサブトラクションを行う。