悪性眼球突出症の病因と治療に関する分子生物学的研究-外眼筋64kDa抗原のcDNAクローニング-

1993 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 05670889
• Research Institution: Kurume University
• Principal Investigator: 広松 雄治 久留米大学, 医学部, 講師 (10201740)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 野中 共平 久留米大学, 医学部, 教授 (80028547) ; 長澤 徳子 久留米大学, 医学部, 助手 ; 於保 美千代 久留米大学, 医学部, 助手 (50248457)
• Keywords: バセドウ病 / ophthalmopathy / cDNA cloning

Research Abstract

これまでにMRIにてバセドウ病眼症患者の外眼筋の腫大やELISA法、ADCC法、Western bolt法にてバセドウ病患者血清中に、外眼筋に対する自己抗体の存在を報告し、外眼筋が本症の病因に重要な役割を果たしている可能性を報告してきた。さらに免疫組織染色法にて、外眼筋がHLA-DR抗原やheat shock protein70を発現していることを報告し、外眼筋が自己免疫反応の標的であることを示した。
そこで外眼筋自己抗原のcDNAクローニングを試みた。
結果
1)患者外眼筋からのcDNAライブラリーの作製
眼症患者より手術時に得た外眼筋からmRNAを抽出し、cDNAを合成し、lambdagt11に組込み、外眼筋cDNAライブラリーの作製した。
2)外眼筋64kDa蛋白のクローニング:大腸菌Y1090にphageを感染させ、plating後IPTGを染み込ませたニトロセルロースフィルターにブロットし、抗ラット外眼筋(64kDa蛋白)抗体陽性患者のプール血清でのスクリーニングを行った。現在までのところ、非特異反応が強く(おそらく大腸菌蛋白と血清中の蛋白、抗体が反応したものであろう)、まだ成功していない。そこでアフィニテイーカラムで抗体の精製を行っており、これができしだいスクリーニング再開する予定である。
2)得られたクローンの解析に用いるRT-PCR法は後眼窩組織におけるheat shock protein70の発現、in situ hybridization法はTSH受容体mRNAの発現、T細胞反応はベルギーのLudgateから分与された1DのT細胞反応の検討より、技術面ではほぼ確立できていおり、ひとたびクローニングができれば、クローンの解析は可能な状態である。