イソプレノイド生合成における鎖延長酵素反応機構の解明

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06403033
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (A)
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 小倉 協三 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (80006303)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐上 博 東北大学, 反応化学研究所, 助手 (10134058) ; 古山 種俊 東北大学, 工学部, 助教授 (20089808)
• Keywords: イソプレノイド / 生合成 / ファルネシル二リン酸合成酵素 / ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素 / プレニルトランスフェラーゼ / ヘプタプレニル二リン酸合成酵素 / イソペンテニル二リン酸合成酵素 / テルペノイド

Research Abstract

1.Bacilus stearothermophilusの遺伝子クローニングにより得た耐熱性のファルネシル二リン酸合成酵素につき、種々の部位特異的変異体を作成し、それらの活性変動を調べた。その結果、従来の予想に反して、完全保存型のシステイン残基が触媒機能に関与せず、セリンで代用できることが証明された。また、すべてのプレニルトランスフェラーゼに共通して存在するFQXXDD配列のうち、FQに関する変異体を検討した。FをAに、QをEに、それぞれ置換した変異体、F-220-AとQ-221-Eではいずれも著しく活性が低下することから、220と221位のフェニルアラニンとグルタミンの残基の重要性が明らかになった。その他、さまざまな変異体を検討したが、C-末端付近のアルギニンやシステインをそれぞれアラニンとフェニルアラニンに置換すると、イソペンテニル二リン酸に対する親和性が低下するが、ゲラニル二リン酸に対する親和性はほとんど変化しないことなどがわかった。
2.ウシ大脳由来のゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の完全精製を達成し、N末端の部分一次構造を決定した。また、この酵素は高等植物の酵素とは異なり、ジメチルアリル二リン酸とイソペンテニル二リン酸との縮合反応を触媒しないことを明らかにした。
3.B.stearothermophilusのヘプタプレニル二リン酸合成酵素を構成する二つの異なるタンパク質の遺伝子クローニングに成功し、それらの塩基配列を決定した。一方のタンパク質は既知のプレニルトランスフェラーゼと一次構造上有意義な相同性を示すが、他方のタンパク質は既知の如何なるタンパク質とも類似性が認められない。しかし、この2つのタンパク質が共存しないと酵素機能を発現しないことが証明された。この2つの遺伝子は機能不明のタンパク質の遺伝子を挟んでDNA上に位置していた。目下、これらの機能と構造の関係を調べることにより、この異例のサブユニット構成の酵素のしくみを解明中である。

Research Products

• [Publications] H.Sagami et al.: "Purification and Properties of Geranylgeranyl Diphosphate Synthase from Bovine Brain." J.Biol.Chem.269. 20561-20566 (1994)
• [Publications] H.Inoue et al.: "Phosphoryration of Farnesol by a Cell-free System from Botryococcus Braunii" Biochem.Biophys.Res.Commun.200. 1036-1041 (1994)
• [Publications] H.Inoue et al.: "Formation of Farnesyl Oleate and Three Other Farnesyl Fatty Acid Esters by Cell-free Extracts from Botryococcus Braunii B Race" Phytochemistry. 36. 1203-1207 (1994)
• [Publications] T.Koyama et al.: "Site-directed Mutagenesis of Farnesyl Diphosphate Synthase:Effect of Substitution on the Three Carboxyl Terminal Amino Acids" Can.J.Chem.72. 75-79 (1994)
• [Publications] T.Koyama et al.: "Thermostable Farnesyl Diphosphate Synthase of Bacillus stearothermophilus:Crystallization and Site-directed Mutagenesis" Acta Biochim.Polonica.41. 281-292 (1994)
• [Publications] H.Sagami et al.: "Purification of Geranylgeranyl Diphosphate from Bovine Brain" Acta Biochim.Polonica.41. 293-302 (1994)
• [Publications] Y.Maki et al.: "Farnesyl Diphosphate Synthase Reactions of Geranyl Diphosphate Analogues Having Oxygen Atoms in Their Alkyl Chains" Chem.Lett.10. 1841-1844 (1994)
• [Publications] T.Koyama et al.: "Structural and Functional Roles of the Cysteine Residues of Bacillus stearothermophilus Farnesyl Diphosphate Synthase" Biochemistry. 33. 12644-12648 (1994)
• [Publications] H.Sagami et al.: "Novel Isoprenoid Modified Proteins in Halobacteria" Biochem.Biophys.Res.Commun.203. 972-976 (1994)
• [Publications] T.Koyama et al.: "Isopentenyl Diphosphate Isomerase in Rubber Latex" Phytochemistry. (in press).
• [Publications] K.Asawatreratanakul et al.: "Characterization of Hevea Isopentenyl Diphosphate Isomerase" Proceedings of the 11th FAOBMB Symposium. (in press).
• [Publications] T.Koyama et al.: "Analysis of Prenyltransferase Reaction Products from C-Serum of Hevea brasiliensis" Proceedings of the 11th FAOBMB Symposium. (in press).
• [Publications] H.Inoue et al.: "Properties of Farnesol Phosphokinase of Botryococcus braunii" Phytochemistry. (in press).
• [Publications] 佐上博 他: "プレニル化蛋白質の発見とイソプレノイド生化学の新展開" 生化学. 12. 1488-1501 (1994)
• [Publications] 小倉協三: "酵素研究の新展開(-島英治他編):イソプレノイド生化学の新展開" 東京化学同人(印刷予定),
• [Publications] 小倉協三: "有機化学の最近の展開(日本化学研究会編):イソプレノイドの生合成化学" 培風館(印刷予定),
• [Publications] 古山種俊: "新タンパク質応用工学第11章第4節" フジテクノシステムズ(株)(印刷予定),