ラット海馬の長期増強を誘発した単一ニューロンに特異的な遺伝子のクローニング

1994 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 06640890
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 丸山 敬 岡崎国立共同研究機構, 生理学研究所, 助教授 (30211577)
• Keywords: 長期増強 / サブトラクション / クローニング / インサイチューハイブリダイゼーション / 分子生物学 / テトラエチル アンモニウム

Research Abstract

長期増強(LTP)の分子機構については、すでに確定された受容体などの活性化や既存のタンパク質の燐酸化などを中心に議論が進められている。我々はLTPに関連した未知の遺伝子の検索を試みている。当初、本研究では、ガラス電極内で逆転写酵素反応を行って、単一神経細胞のライブラリを作成することを目指した。しかし、技術的な問題から満足な結果は得られなかった。そこで、海馬スライスをKチャンネル阻害剤tetraetylammnonium(TEA)処理するとによって、その海馬全体にLTPを誘因し、この状態で特異的に発言される遺伝子を差分法とin situ hybridization(ISH)を用いて検索することを試みた。
TEA処理したスライスよりλZAPcDNAライブラリを作成し、ヘルパーファージにより一本鎖のアンチセンスライブラリとした。脳全体のRNAを精製し、InVitrogen社のサブトラクターによりビオチン化した。大過剰のビオチン化脳RNAと海馬由来の一本鎖DNAを混合すると、共通のメッセージは、ビオチン化したRNAと二本鎖を形成し、フェノール抽出によって取り除くことができる。残った一本鎖DNAを大腸菌にトランスフェクトすることによって差分ライブラリを作成した。一個ずつクローンを拾っていき、300個程度それぞれのアンチセンスのプローブを作成し、ISHにより特異な細胞に発現している遺伝子を検索していった。その結果、あるニューロンにのみ発現しているものが見いだされた、そのいくつかは、核酸の部分配列のデーターベースのホモロジー検索では、未知のものであった。まだ機能などはまったく不明であるが、新しい遺伝子の同定が期待される。
本研究では、極く限られた神経系細胞に発現している遺伝子も検出される可能性がある。同定された未知の遺伝子の全長を得ることによって、その機能を検討していく予定である。

Research Products

• [Publications] 丸山敬,葛目博子,川村勇樹,浅田英穂,関野祐子,小幡邦彦: "ラット海馬の長期増強(LTP)に関連して発現する遺伝子の検索の試み" 神経化学. 33. 616-617 (1994)