1996 Fiscal Year Annual Research Report

核内蛋白との相互作用によるDNAポリメラーゼα・プライマーゼの複製開始制御

Research Project

Project/Area Number	07457037
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	よし田松年名古屋大学, 医学部, 教授 (70090420)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	小泉恵子名古屋大学, 医学部, 講師 (00118027)
Keywords	網膜芽細胞種遺伝子RB蛋白 / DNAポリメラーゼα / バキュロウイルス / Raji細胞 / 複製因子 / RP-A / DNAプライマーゼ
Research Abstract	哺乳類細胞のDNA複製酵素と調節因子との蛋白-蛋白相互作用を解析してG1/S移行の機構にアプローチすることを目的として以下の実験を行った。リン酸化型のRb蛋白が、複製系の酵素、特にDNAポリメラーゼα・プライマーゼの活性を強く促進するという予備的結果を得た。この結果は予想外ではあったが、Rb蛋白がG1期においては低リン酸化型でありE2Fなど転写因子と結合して転写を抑制するがS期には高度にリン酸化された「不活性形」で存在するという細胞周期におけるリン酸化サイクルとよく符号し、従来不明であったリン酸化型Rb蛋白の機能を示唆するものである。Rb蛋白はバキュロウイルス・昆虫細胞系で大量発現させ抗Rb抗体カラムにより精製した。またヒト白血病培養系Raji細胞核より同様に精製した。DNAポリメラーゼαは牛胸腺及びヒトHela細胞より抗体カラムを用いて精製した。それぞれ二種類の組み合わせた実験でRb蛋白それ自体がDNAポリメラーゼαを10-50倍に活性化することを認めた。Rb蛋白をポテト酸ホスファターゼおよびホスファターゼ2Aで脱リン酸化すると促進活性は消失し、リン酸化Rb蛋白が促進活性を担っていることが明らかとなった。ビーズに固定したRb蛋白カラムを用いてリン酸化Rb蛋白とDNAポリメラーゼαは直接結合する事が示され、蛋白-蛋白相互作用によって活性促進がもたらされる事を示した。一方、複製蛋白RP-AはDNAプライマーゼの塩基配列特異的結合・開始を修飾する事を明らかにした。従来DNAプライマーゼはピリミヂンに富む配列を有する一本鎖DNAがのみプライマーRNA合成を行う事が知られているがRP-Aを結合したDNA上ではプリンに富む配列に結合してプライマーRNAを合成し複製をスタートすることが明らかとなった。複製フォークに於ける岡崎断片の開始機構に示唆を与える結果として興味深い。

Research Products

(13 results)

All Other

All Publications (13 results)

[Publications] M.Suzuki: "Replication protein-A mediates the association of calf thymus DNA polymerase α-DNA primasecomplex with guanine-rich DNA sequence." Journal of Biochemisry. 120. 766-772 (1996)
[Publications] T.Oishi: "Purification and characterization of nuclear alkaline phospholipase A2 in rat ascites hepatoma cells." FEBS letters. 394. 55-60 (1996)
[Publications] S.Mizuno: "Portal vein occlusion induces cell proliferation of cholestatic rat liver." Journal of Surgical Research. 60. 249-257 (1996)
[Publications] Y.Mizushina: "Fatty acids selectively inhibit eukaryotic DNA polymerase activities in vitro." Biocimica et Biophsica Acta. 1308. 256-262 (1996)
[Publications] S.Izuta: "Chain termination with sugar-modified nucleotide analogues in the DNA synthesis by DNA polymerase γ." Nucleosides & Nucleotides. 15. 1-3 (1996)
[Publications] M.Shoji-Kawaguchi: "Selective inhibition of DNA polymerase epsilon by phosphatydyl inositol." Journal of Biochemistry. 117. 1095-1099 (1995)
[Publications] T.Sakurai: "Antioncogene product p53 binds DNA helicase." Experimental Cell Research. 215. 57-62 (1994)
[Publications] C.M.G.Simbulan: "Sphingosine inhibits the synthesis of RNA primers by primase in vitro." Biochemistry. 33. 9007-9012 (1994)
[Publications] M.Suzuki: "DNA polymerase α overcomes an error-prone pausesite in the presence of replication protein A." Journal of Biological Chemistry. 269. 10225-10228 (1994)
[Publications] M.Asano: "Purification and characterization of nuclear phospholipase C specific for phosphoinositides." Journal of Biological Chemistry. 269. 12360-12366 (1994)
[Publications] C.M.G.Simbulan: "Sulphate-and sialic acid-containing glycolipids inhibit DNA polymerase α activity." Biochimica Biophsica Acta. 1205. 68-74 (1994)
[Publications] H.Suzuki: "Internal biliary drainage,unlide external drainage,does not suppress the regeneration of cholestatic rat liver after partial hepatectomy." Hepatology. 20. 1318-1321 (1994)
[Publications] 松影昭夫: "DNA複製とその制御" 東京大学出版会, 172 (1996)

1996 Fiscal Year Annual Research Report

核内蛋白との相互作用によるDNAポリメラーゼα・プライマーゼの複製開始制御

Principal Investigator

よし田 松年 名古屋大学, 医学部, 教授 (70090420)

Research Products

[Publications] M.Suzuki: "Replication protein-A mediates the association of calf thymus DNA polymerase α-DNA primasecomplex with guanine-rich DNA sequence." Journal of Biochemisry. 120. 766-772 (1996)

[Publications] T.Oishi: "Purification and characterization of nuclear alkaline phospholipase A2 in rat ascites hepatoma cells." FEBS letters. 394. 55-60 (1996)

[Publications] S.Mizuno: "Portal vein occlusion induces cell proliferation of cholestatic rat liver." Journal of Surgical Research. 60. 249-257 (1996)

[Publications] Y.Mizushina: "Fatty acids selectively inhibit eukaryotic DNA polymerase activities in vitro." Biocimica et Biophsica Acta. 1308. 256-262 (1996)

[Publications] S.Izuta: "Chain termination with sugar-modified nucleotide analogues in the DNA synthesis by DNA polymerase γ." Nucleosides & Nucleotides. 15. 1-3 (1996)

[Publications] M.Shoji-Kawaguchi: "Selective inhibition of DNA polymerase epsilon by phosphatydyl inositol." Journal of Biochemistry. 117. 1095-1099 (1995)

[Publications] T.Sakurai: "Antioncogene product p53 binds DNA helicase." Experimental Cell Research. 215. 57-62 (1994)

[Publications] C.M.G.Simbulan: "Sphingosine inhibits the synthesis of RNA primers by primase in vitro." Biochemistry. 33. 9007-9012 (1994)

[Publications] M.Suzuki: "DNA polymerase α overcomes an error-prone pausesite in the presence of replication protein A." Journal of Biological Chemistry. 269. 10225-10228 (1994)

[Publications] M.Asano: "Purification and characterization of nuclear phospholipase C specific for phosphoinositides." Journal of Biological Chemistry. 269. 12360-12366 (1994)

[Publications] C.M.G.Simbulan: "Sulphate-and sialic acid-containing glycolipids inhibit DNA polymerase α activity." Biochimica Biophsica Acta. 1205. 68-74 (1994)

[Publications] H.Suzuki: "Internal biliary drainage,unlide external drainage,does not suppress the regeneration of cholestatic rat liver after partial hepatectomy." Hepatology. 20. 1318-1321 (1994)

[Publications] 松影昭夫: "DNA複製とその制御" 東京大学出版会, 172 (1996)

よし田松年名古屋大学, 医学部, 教授 (70090420)