耐熱性酵素の利用によるC-C結合形成反応の新しい触媒の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07555252
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 古山 種俊 東北大学, 工学部, 助教授 (20089808)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小池 あゆみ トヨタ自動車(株), 第一FP部, 研究員 ; 小倉 協三 東北大学, 反応化学研究所, 教授 (80006303) ; 西野 徳三 東北大学, 工学部, 教授 (90005827)
• Keywords: ファルネシルニリン酸 / プレニルトランスフェラーゼ / 耐熱性酵素 / ポリプレニルニリン酸 / イソプレン鎖延長 / イソプレノイド生合成 / 大量発現系 / キメラ体酵素

Research Abstract

本研究は生理活性物質の不斉合成に有効である「プレニルトランスフェラーゼ」をより高度な触媒機能を有する.C-C結合形成反応の新しい触媒として利用するために、耐熱性プレニルトランスフェラーゼの遺伝子に対し、遺伝子工学的技術を駆使して各種の変異体酵素を作製し、野生型酵素では不可能なC-C結合形成反応を触媒する新規な酵素の創製を目的として、研究を行い、最終年度である本年度で、以下のような成果を得た。
1.Bacillus stearothermophilusのファルネシルニリン酸(C_<15>PP)合成酵素の改変
(1)部位特異的変異の導入により、C-15までのイソプレン鎖延長反応の触媒機能をC-25までの鎖延長反応まで出来るように改変した。(2)2種類のタンパク質を大腸菌の同一細胞内で大量発現させるプラスミドの構築に成功した。これにより、野生型のホモニ両体構造を持つC_<15>PP合成酵素を一方は部位特異的変異導入により不活性化したサブユニットに代えた、ヘテロサブユニット構造を持つ新規酵素を大量に得ることができるようになり、C_<15>PP合成酵素のホモ二重体構造と触媒機能発現機構との関係を明らかにすることができた。
2.他のプレニルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングと大量発現系の構築
(1)Micrococcus Iuteus B-P 26のヘキサプレニルニリン酸(C_<30>PP)合成酵素の遺伝子をクローン化し、二つのヘテロサブユニットの大量発現系を開発した。(2)Bacillus subtilisのヘプタプレニルニリン酸(C_<35>PP)合成酵素の遺伝子のクローン化を行い、大量発現系を構築した。(3)Paracoccus denitrificansのデカプレニルニリン酸(C_<50>PP)合成酵素の遺伝子クローニングを行い、発現系を構築した。(4)上記の各酵素のサブユニットとC_<15>PP合成酵素のサブユニット間とのハイブリッド型酵素を作製し、新奇なプレニルトランスフェラーゼ活性を示す酵素の創製を行った。(5)C_<35>PP合成酵素とC_<35>PP合成酵素とのキメラ体酵素を作製し、新規な触媒機能を有するプレニルトランスフェラーゼを創製した。

Research Products

• [Publications] Koyama, Tanetoshi: "Identification of Significant Residues in the Substrate Binding Site of Bacillus stearothermophilus Farnesyl Diphosphate Synthase" Biochemistry. 35. 9533-9538 (1996)
• [Publications] Ohnuma, Shin-ichi: "Conversion from Famesyl Diphosphate to Geranylgeranyl Diphosphate Synthase by Random Chemical Mutagenesis" J. Biol. Chem.271. 10087-10095 (1996)
• [Publications] Koyama, Tanetoshi: "Isopentenyl Diphosphate Isomerase in Rubber Latex" Phytochemistry. 43. 769-772 (1996)
• [Publications] Yuan-Wei, Zhang: "Two Cistrons of the gerC Operon of Bacillus subtilis Eneode the Two Subunits of Heptaprenyl Diphosphate Synthase" J. Bacteriology. (in press.)
• [Publications] Koike-Takeshita, Ayumi: "Identification of a Novel Gene Cluster Participating in Menaquinone (Vitamin K_2) Biosynthesis. Cloning and sequence Determination of the 2-Heptaprenyl-1, 4-naphthoquinone Methyltransferase Gene of B. stearothemophilus" J. Biol. Chem.(in press.).
• [Publications] Koyama, Tanetoshi: "Comprehensive Natural Product Chemistry" Elsevier Science (in press.),
• [Publications] Ogura, Kyozo: "Dynamic Aspects of Natural Products Chemistry" Kodansha Scientific, 1-23 (1996)