チロジン水酸化酵素遺伝子発現の可視化によるメンケス病マウス脳の病態解析

1995 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 07670691
• Research Category: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 吉村 教あき 弘前大学, 医学部, 助教授 (60018893)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 佐藤 剛 弘前大学, 医療技術短期大学部, 助教授 (80003490)
• Keywords: ハイブリダイゼーション組織化学 / メンケス病モデルマウス / 脳 / チロヂン水酸化酵素 / mRNA発現 / ヂゴキシゲニン / 免疫組織化学

Research Abstract

未治療brindled mouse (BM)と正常対照マウスの脳組織におけるtyrosine hydroxylase (TOH)とそのmRNA発現の局在.
1.未治療の12日齢BM5匹とその正常対照マウス5匹の脳組織におけるTOHの局在を免疫組織化学的に(SAB法,ニチレイキットで)調べた.その結果共にsubstantia nigra,locus coeruleus,nucleus raphe linearis,periaqueductal gray,pontine reticular nucleusなどのニューロンが陽性反応を呈したが,BMと対照とのあいだに免疫反応性の明らかな差は認められなかった.
2.未治療の12日齢BM5匹とその正常対照マウス5匹の脳組織におけるTOH mRNAの発現をin situ hybridization組織化学法により以下の手順で調べた.(1)プローブの調整:データベースからマウスTOH cDNA sequenceの一定の長さ(50mer)に相当するオリゴヌクレオチドを合成し,これにジゴキシゲニンを取り込ませてラベルしプライマーとした.(2)組織ブロックの作製:動物から脳をとりだし直ちに4%パラホルムアルデヒド-PBSで24時間(4℃)固定,エタノールで充分脱水(4℃),キシレンを通してパラフィン包埋(対照脳とBM脳を並べて一緒に包埋).(3)4μmの切片を切り37℃の乾燥板上で4時間以上かけてよく乾燥させ冷蔵庫(4℃)に保存.(4)切片の前処理(脱パラ後プロテイナーゼ処理).(5)ハイブリダイゼーション:ハイブリダイゼーション溶液を調整し(80℃),この溶液でプローブを50倍に希釈しよく混合し3分間加温(85℃)する(denaturation).この溶液を前処理した切片に滴下しパラフィルムで覆い湿箱中で50℃,16時間ハイブリダイズした.(6)プローブの洗浄.(7)坑体反応,発色反応.結果と考察:BM脳と正常対照脳共にsubstantia nigra,locus coeruleus,nucleus raphe linearis,しかし,periaqueductal gray,pontine reticular nucleusなどのニューロンの細胞質中にシグナル発現をみとめた.シグナルが一般に弱いこと,マウスにより個体差がある上に切片における脳構造のレベルの違いにもとづく差も考えられるので,BM脳と対照脳におけるこれら構造でのシグナル発現に差があるかどうかについてはもう少し実験を反復し検討する必要がある.