溶液中の蛋白質分子の動態を観察するエバネッセント光顕微鏡の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557002
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Section: 試験
• Research Institution: Kitasato University
• Principal Investigator: 二重作 豊 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (50014197)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大沢 久雄 (株)ニコン, 技術開発部, 係長 ; 鈴木 正敏 (株)ニコン, 顕微鏡開発部, 係長 ; 関矢 加智子 北里大学, 薬学部, 講師 (30050579) ; 渡辺 美宰 北里大学, 衛生学部, 助手 (40255360)
• Keywords: エバネッセント光顕微鏡 / 溶液中 / 光散乱 / AFM / SLO / 生体膜 / 蛋白分子 / 動態観察

Research Abstract

直径2nmのSLO分子が、赤血球膜上に形成する直径27nmの孔をリアルタイムに観察し、孔形成の機構を解明する為に、新たに超高分解能のエバネッセント光顕微鏡を開発中である。これまでに究明された孔形成の機構は、まずSLO分子が膜に付着し、次に膜上を移動してSLO分子が会合し、最後に成長したリング状のポリマーが、膜に沈んで孔を開けると言う筋書であるが、最後のステップは、現存の観測機器では補足できない。
1.分解能: 市販のエバネッセント光顕微鏡は、尖らせた光ファイバを金属膜でコートし、先端に微小開口を開け、そこから光を照射または検出するものである。この方式の分解能は開口径で制限され、50nm程度が限界である。今回の用途には分解能が不足である。そこで、AFMプローブの鋭い針先による光散乱を利用した手法を用いることにより、数nm〜10nm程度の分解能を目指した。
2.観察時間: リング形成は37℃では2〜3分で終了する。しかし、プローブ顕微鏡の画像取得時間は数分から十数分かかる。そこで、試料の温度を下げてリング形成の速度を遅くして観察するために、装置に温調器を組み込んだ。
3.装置構成: 市販の倒立顕微鏡のステージ上に液中観察用に開発したAFMヘッドを載せる。試料はステージ上の温調器のシャーレに入れる。微分干渉の照明系で試料を照射し、AFMプローブで表面のエバネッセント場を散乱させる。検出は光学顕微鏡の光学系を介し出力ポートの外に光検出器を配置した。
4.装置開発の進行状況: エバネッセント光の検出方式の検討後、装置の設計・製作を行い、現在試料の観察をしながら調整中である。
5.試料の調整: 装置の調整と改良の為に、種々の固さの試料を準備した。
平成8年度は、装置の開発に主眼を置き、本年度の計画は達成されつつある。