臨床診断応用へのin situハイブリダイゼーションシステムの開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08557020
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Section: 試験
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 野村 慎太郎 大阪大学, 医学部, 助教授 (80159087)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北条 昭次 (株)サクラ精機, 開発本部病理学研究室, 室長 ; 北村 幸彦 大阪大学, 医学部, 教授 (70028520)
• Keywords: in situハイブリダイゼーション / 抗体反応 / 銀増感法 / ジゴキシゲニン / 全自動検出システム / ハイブリダイゼーション / ケモルミネッセンス / ウイルス検出

Research Abstract

病理学に規定される疾病のほとんどはその原因を分子レベル、特に核酸の変化によるものに置き換えられることが明らかになってきた。最近開発された核酸検出系としてのin situハイブリダイゼーション法は病理組織の分子レベルでの診断技術として注目されている。
本研究計画では再現性と定量性に富んだ全自動非アイソトープシステムによる高感度in situ核酸検出系の確立を目的とし、これに必要な基礎的な条件の設定と機器の開発を行ない、以下の成果を得た。1.非アイソトープ系における高感度in situハイブリダイゼーション法を確立した。プローブの標識は生体内に存在しないジゴキシゲニンで行ないその検出系は抗ジゴキシゲニン-パーオキシダーゼ結合抗体を用いて、ケモルミネッセンス発光系、銀増感法を採用し、従来のアルカリファオスファターゼ-NBT/BCIP法の約10倍の感度を得た。
2.このシステムはアイソトープを全く利用しないので全自動化が従来の方法に比べてきわめて容易であった。組織切片の前処理から検出までの全ステップをプログラムした機器の試作を試みた。まず、市販されている全自動染色装置、全自動免疫染色装置がin situハイブリダイゼーション法に転用できるかを検討し、その条件設定を行なった。市販されている装置に合わせた緩衝液の調整法に詳細な検討を加え、手動で行なっていた結果に匹敵する組織染色像を得た。

Research Products

• [Publications] K.Takebayashi: "Reseesire phenotype disployed by dominant negative MITF mutant is a result of impared nuclear localization potential" Hol.Cell.Biol.16. 1203-1211 (1996)
• [Publications] T.Kimura: "Expression of oxytocin receptor in human pregnant myometrium" Endocrinology. 137. 780-785 (1996)
• [Publications] Y.Nakajima: "Identification of a cell types of adontoma-life clustere in microphthalmic (mi/mi) mice using in situ hybridization" Pathol.Int.46. 743-750 (1996)
• [Publications] K.Tokunaga: "Human osteosarcoma(OST)induces mouse reactive bone formation in yenograft system" Bone. 19. 447-454 (1996)
• [Publications] S.Nomura: "Cellular localization of thrombopoietin mRNA in the liver by in situ hybridization" Exp Haematol. (印刷中).
• [Publications] T.Takemura: "Localization of bone morplwgenetic protein-4 messenger RNA in developing mouse cochlea" Hearing Res.95. 26-32 (1996)