タンパク質およびRNAの高次構造解析のための新しい安定同位体標識NMR法の開発

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08558076
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Section: 試験
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 横山 茂之 東京大学, 大学院・理学系研究科, 教授 (00159229)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岡田 務 日本酸素株式会社, 事業企画部, 専門部長 ; 伊藤 隆 理化学研究所, 遺伝生化学研究室, 研究員補 (80261147) ; 木川 隆則 理化学研究所, 細胞情報伝達研究室, 研究員 (20270598) ; 河合 剛太 東京大学, 大学院・理学系研究科, 講師 (70211860) ; 武藤 裕 東京大学, 大学院・理学系研究科, 講師 (30192769)
• Keywords: NMR / タンパク質 / RNA / 安定同位体標識 / 選択的標識 / 重水素化 / 立体構造 / 無細胞タンパク質合成系

Research Abstract

本年度は,分子量が数万を超えるタンパク質のNMRによる解析のために,2つのアプローチで新手法の開発を行った.一方,高分子量RNAのNMR解析のための基本的手法として,重水素化RNAの調製方法を確立した.
1.分子量が数万以上のタンパク質,およびタンパク質間相互作用を,NMRを用いて解析するための新たな標識方法として,無細胞タンパク質合成系による残基特異的安定同位体標識法の開発を行った.具体的には,Rasタンパク質において,標的分子との相互作用に特に重要な役割を果たす,32位のチロシン残基のみを安定同位体(^<15>N)標識し,そのNMRスペクトルを測定することに成功した.
2.分子量が3〜4万のタンパク質についてその立体構造をNMRによって決定するために,アミノ酸選択的プロトン標織法を開発した.大腸菌による発現系を用いて,ILV-^1H,^<13>C/FY-^1H/u-^2H/u-^<15>Nタンパク質を調製し解析を行ったところ,タンパク質のコアを形成するこれらの残基由来の限られた距離情報を用いることで大きなタンパク質の高次構造を効率良く決定できることが明らかになった.
3.従来より開発を進めている酵母を用いた標識ヌクレオチド生産系を応用し,30〜70%に重水素化されたNTPを調製することに成功した.^1Hおよび^<13>CNMR測定の結果,リボースおよび塩基の非交換性のすべてのプロトンについてほぼ均一に重水素標識ができることが確認された.さらに,^<13>C,^<15>N,50%^2H標識されたNTPの調製も行なった.得られたNTPを用いて17残基の標織RNAを調製し,そのNMRスペクトルの測定を行ったところ,プロトンシグナルの線幅の減少が確認できた.しかしながら,これは重水素化によるシグナル強度の減少を相殺するほどではなく,現在はさらに分子量の大きなRNAについて重水素化の効果を検討する準備を進めている.

Research Products

• [Publications] Smith,B.O.: "An approach to global fold determination using limited NMR data from larger proteins selectively protonated at specific residue types" J.Biomol.NMR. 8. 360-368 (1996)
• [Publications] Kim,D.-M.: "A highly efficient cell-free protein synthesis system from Escherichia coli" Biochem.239. 881-886 (1996)