突然変異検出系を導入した胚幹細胞による薬剤性初期発生傷害の短期検知システム

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08559016
• Research Institution: National Institute of Health Sciences
• Principal Investigator: 井上 達 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 部長 (50100110)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相賀 裕美子 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 室長 (50221271) ; 平林 容子 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 主任研究官 (30291115) ; 高木 篤也 国立医薬品食品衛生研究所, 安全性生物試験研究センター・毒性部, 主任研究官 (00179417)
• Keywords: 胚幹細胞 / 発生傷害 / 分化

Research Abstract

未分化な形質を保持したES細胞の生殖・発生毒性のin vitro試験系への応用は有用であると思われる。本研究では、このES細胞を用いた鋭敏かつ簡便に遺伝子突然変異を検出できる系の樹立を最終目的に研究を行った。突然変異検出用遺伝子として、大腸菌のgpt遺伝子を導入した。一方、マウスの内在するhprt(hypoxanthine phosphoribosyl transferase)遺伝子の存在が突然変異検出の障害となる。そこでhprt遺伝子が欠失したマウスES細胞株(American Type Culture Collectionより得た129系雄マウス由来のhprt遺伝子欠失ES細胞株(ES-E14TG2a))を実験に使用した。大腸菌のgpt遺伝子を含むプラスミド(psv2-gpt)はJCRB GENE BANKより入手したものを使用した10μgの環状プラスミドをHBS(Hepes-buffer saline)に溶解し、約5x10^6から1X107個のhprt(-)ES細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。エレクトロポレーションの条件は、250V、500μFで行いBiorad社のGene Pulserを使用した。エレクトロポレーションしたES細胞はfeeder細胞上に10cm径のdish当たり、5x10^6個播種した。Hypoxanthine-aminopterine-thymidene(HAT)選択は、通常のES用培地から、ヌクレオシドを除いたものに120μMのhypoxanthine、0.4μMのaminopterin、20μMのthymidineを加え、さらに、HAT培地に加えて、10μg/mlのmycophenolic acidおよび185μM adenineを添加し、2週間培養した結果、コロニーの出現が認められ、最終的に5個のESクローンを得ることが出来た。クローニングされたES細胞(5クローン)の自然突然変異頻度を調べるため、ES細胞をゼラチンコートされた10cm径のdishに1x10^6個播種し、通常のES用培地から、ヌクレオシドを除いたものに、l0μMの6-チオグアニンを添加して、11日間培養した結果、それぞれ、6TG耐性コロニーが10^6当たり20から30個認められた。この値は、報告されているES細胞の自然突然変異頻度(10^8個に1個)に比べて突然変異頻度が高く (検出感度が高い)、突然変異検出系として高感度なHPRT(-)gpt(+)ES細胞株を樹立することが出来た。

Research Products

• [Publications] Momma, J., Kitajima S., Inoue T.: "The guinea-pig skin sensitization test revisited: an evaluation formula to predict possible sensitization levels for eight chemicals used in housefould products." Toxicology. 126. 75-82 (1998)
• [Publications] Hirabayashi Y., Inoue T.et al.: "Cell kinetics of hemapoietic colony-foming units in spleen(CFU-S)in young and old mice." Mechanisms of Ageing and Development.101. 221-231 (1998)
• [Publications] Inoue T: "Hematopoietic cell growth factors and their receptors" International Journal of Hematology. 67. 101-103 (1998)
• [Publications] 菅野純、相賀裕美子、井上達: "化学物質の生物毒性試験-内分泌障害性を中心に" 組織培養工学. 24. 268-271 (1998)
• [Publications] Inoue T.: "(eds.DnArcy PF & Harron DWG.) Queens University of Belfast" Concept of a relavant animal model,In: Proceedings of the Forth International Conference on Harmonisation, 209-223 (1998)
• [Publications] Inoue T: "Eds.Griffiths SA and Lumley CE,Kluewer Academic Publishers,London" Biotechnologycall-derived pharmaceuticals in Japan: Present and future prospects,In Safety Evaluation of Biotechnologycally-derived phrmaceuticals: Facilitating a scientific approach,Proceedings of a CMR International Workshop held at Ashdown Park Hotel,Wych Cross,UK, 51-63 (1988)