レンサ球菌のサイクリックADPリボース代謝酵素の一次構造の決定と活性部位の解析

1996 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 08670303
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 唐澤 忠宏 金沢大学, 医学部, 助手 (90251917)
• Keywords: A群レンサ球菌 / Streptococcus pyogenes / NAD / サイクリックADPリボース / クローニング

Research Abstract

A群レンサ球菌NAD分解酵素をコードする遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
1.方法1
精製したNAD分解酵素のN末アミノ酸配列を決定し、それを基にオリゴヌクレオチドを合成した。当初、このオリゴヌクレオチド(21bp)をプローブとして遺伝子ライブラリーをスクリーニングしていたが、非特異反応のためにクローニングができなかった。これはA群レンサ球菌がlow G+C contentを示す結果であると考えられた。そこで、オリゴヌクレオチドの特異性を高めるために、さらに多くのN末アミノ酸配列を推定し、PCR用オリゴヌクレオチドプライマーを作製した。low G+C contentによる非特異反応はPCRにても依然観察されたが、種々の条件を検討しながらPCRを行った結果、予想される大きさのDNA断片(120bp)が遺伝子ライブラリーより増幅された。このDNA断片をクローニングし、塩基配列を決定したところ、A群レンサ球菌NAD分解酵素をコードする遺伝子の一部であることが判明した(未発表データ)。現在この断片をプローブとして構造遺伝子全体のクローニングを続行中である。
2.方法2
方法1が先行したため、遺伝子クローニングと塩基配列の決定という観点からは、方法2は方法1の確認あるいは補助的な役割を担うこととなった。
NAD分解酵素精製標品をウサギに免疫して、血清を得た。その血清から免疫グロブリン抗体を精製した。今後この抗体を利用してELISAの系を確立する予定である。