古細菌におけるアミノ酸ラセマーゼ及びD-アミノ酸の分布とその機能の解明

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09460053
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 養王田 正文 東京農工大学, 工学部, 助教授 (50250105)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 丸山 正 海洋バイオテクノロジー研究所, 釜石研究所, 主任研究員 ; 江崎 信芳 京都大学, 化学研究所, 教授 (50135597) ; 今井 一洋 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (50012620) ; 香川 靖雄 女子栄養大学, 医化学研究室, 教授 (30048962)
• Keywords: アミノ酸ラセマーゼ / D-アミノ酸 / 古細菌 / 超好熱菌 / エピメラーゼ / アスパラギン酸 / ジアミノピメリン酸 / PLP非依存

Research Abstract

様々な古細菌にD-アミノ酸が存在することを明らかにした.その結果,超好熱性古細菌であるThermococcus属およびPyrococcus属にはほぼ普遍的にD-アミノ酸が存在することがわかった,特にアスパラギン酸のほとんどラセミ化していた.Thermococcus KS-8由来アスパラギン酸ラセマーゼの全長遺伝子を単離し,大腸菌で生産した.この組換え体は70℃でアスパラギン酸ラセマーゼ活性を有しており,微弱ではあるがグルタミン酸など他のアミノ酸に対するラセマーゼ活性もあった.ゲノム解析の結果で超好熱性菌Archaeoglobus fulgidusにも類似の遺伝子が存在することが分かっている.データベース上ではこの遺伝子はアスパラギン酸ラセマーゼをコードしているとなっているが未確定である.そこで,この蛋白質をゲノム配列を基にPCRで増幅し大腸菌により生産したが,アスパラギン酸ラセマーゼ活性はなかった.そこで更に詳細に調べるとこの遺伝はアスパラギン酸ラセマーゼが存在しない大腸菌の機能不明な遺伝子orfXと最も高い相同性を有していた.この遺伝子はLysine生合成の最終段階の酵素であるDiaminopimelate Decarboxylase遺伝子に隣接して存在しており,その前の段階の酵素でありアミノ酸ラセマーゼと本質的に同じ反応機構を有するDiaminopimelate Epimeraseではないかと推測して活性測定を行っている.また,最近全ゲノム配列が解明されたPyrococcus horikoshiiには2種類のアスパラギン酸ラセマーゼ相同遺伝子が存在したが,一方はDSYのアスパラギン酸ラセマーゼと高い相同性があり,もう一方はArchaeoglobusの相同遺伝子と類似していた.これらの機能を明らかにするために遺伝子配列を基に大腸菌による発現系を作成した.