カルシウムーミリストスイッチ機構の原子の原子レベルでの解明

1998 Fiscal Year Final Research Report Summary

• Project/Area Number: 09680644
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Biophysics
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 田中 俊之 筑波大学, 応用生物化学系, 講師 (10217052)
• Project Period (FY): 1997 – 1998
• Keywords: リカバリン / ニューロカルシン / カルシウムーミリストスイッチ / EFハンド / 多次元NMR / 溶液構造

Research Abstract

リカバリンのN末端は脂肪酸(主にミリストイル酸)で修飾されており、この疎水性部分を利用してカルシウム依存的に細胞膜と相互作用する(カルシウム ーミリストイルスイッチ)。本研究では、リカバリンファミリーに属する蛋白質の詳細なNMR構造解析を行い、このスイッチ機構を原子レベルで理解することを目的とする。
1)カルシウム非存在下のリカバリンの構造解析
カルシウム非結合状態のリカバリンに関して、βメチレンとメチルのステレオ特異的な帰属を行い、NOESYスベクトルの再解析を行った。この結果、新たに532個の距離情報が得られ、カルシウム非存在下のリカバリンの三次元構造を精密化することに成功した。これにより、疎水性ポケット中のミリストイル基の形状とその周囲の疎水性残基の配置などを明らかにした。
2)カルシウム存在下のリカバリンの構造解析
カルシウムを結合したリカバリンの各種異種核多次元NMRスペクトルを測定し、常法にしたがつて主鎖及び側鎖のシグナルをほぼ完全に帰属した。次に、この帰属を基にしてNMRスペクトルを解析し、併せて2,438個の距離情報と二面角情報を得た。これらを用いて三次元構造を決定し、ミリストイル基が、カルシウムの結合と運動して蛋白質表面に飛び出すことを明らかにした。また、N末端ドメインの表面に疎水性クレバスが形成されることもわかった。
3)カルシウム非存在下のニューロカルシンの構造解析
カルシウム非存在下で、ニューロカルシンの各種異種核多次元NMRスペクトルを測定した。現在、約95%の主鎖及び約70%の側鎖の帰属が終了している。帰属された主鎖の^1H、^<13>C、^<15>Nの化学シフトとNOEデータから、二次構造が11本のαヘリックスと4本の短いβストランドから構成されていること、更にこの4本のβストランドが2組の逆平行型βシートを形成していることを明らかにした。

Research Products

• [Publications] James B. Ames: "Molecular Mechanics of Cacuim-Myristoyl Switches"Nature. 389. 198-202 (1997)
• [Publications] Toshiyuki Tanaka: "Differential Isotope Labeling Strategy for Determining the Structure of Myristoylated Recoverin by NMR Spectroscopy"J. Biomol. NMR. 11. 135-152 (1998)