1997 Fiscal Year Annual Research Report
新しいヒトG-蛋白質共役受容体EDGファミリーのリガンド決定と生理機能の解析
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09770026
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| Research Institution | Kagawa Medical School |
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Principal Investigator |
山口 文徳 香川医科大学, 医学部, 助手 (40271085)
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| Keywords | EDGレセプター / Biopanning / リガンド / G-蛋白共役受容体 |
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| Research Abstract |
レセプターに対する未知のリガンド確定の新しい方法として、biopanning法を用いた実験を行った。まず、この新しい方法の実験条件を確立するためにコントロールとしてリガンドが確定し、よく研究されているアンギオテンシンレセプターを選択した。アンギオテンシンレセプターに特異的なプライマーを作成し、cDNAをテンプレートとしてRT-PCRを行い、レセプターをコードするDNAフラグメントを得た。このフラグメントをヒスチジンタグをコードする塩基配列をもつベクターに組み込んだ。さらにこのヒスチジンタグおよびレセプター配列を含むフラグメントを取り出すために新しいプライマーを作成し、PCRを行った。得られたフラグメントをほ乳類細胞にトランスフェクションすべく、ほ乳類細胞発現ベクターに組み込んだ。このレセプター蛋白を発現させるため、COS7細胞を培養し、DEAE-デキストラン法により、トランスフェクションを行った。発現された蛋白を回収・調整し、ペプチドディスプレイファージライブラリーとインキュベートし、スクリーニングによってレセプターと結合するペプチドのコンセンサスを決定した。
EDG-3レセプターのリガンド決定を行うため、同様にベクターに組み込むべく、PCRのためのプライマーを作成し、RT-PCRにてレセプターをコードするDNAフラグメントを得た。このフラグメントをほ乳類細胞発現ベクターに導入し、発現蛋白を回収した。現在この蛋白を用いてこのレセプターに結合するペプチドのコンセンサスを決定中である。
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