新しいヒトG-蛋白質共役受容体EDGファミリーのリガンド決定と生理機能の解析(Biopanning法による未知のレセプターのリガンド決定法の確立)

1998 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 09770026
• Research Institution: Kagawa Medical School
• Principal Investigator: 山口 文徳 香川医科大学, 医学部, 助手 (40271085)
• Keywords: Biopanning法 / G蛋白共役レセプター / アンギオテンシンレセプター

Research Abstract

Biopanning法を応用したG蛋白共役レセプターのリガンド確定法のコントロールとして既存のアンギオテンシンレセプターのcDNA配列をデータベースから得て、PCRにて coding regionを増幅し、蛋白発現ベクターに組み込んだ。このベクターを使ってほ乳類培養細胞でアンギオテンシンレセプター蛋白を大量に発現させた。
蛋白発現の際に蛋白の末端に6個のアミノ酸からなるヒスチジンタグを付け、発現したアンギオテンシンレセプターのみを選択的に回収できるようにした。
次にこのアシギオテンシンレセプター蛋白とランダムなペプチドを発現しているファージライブラリーを混合してアシギオテンシンレセプターに親和性をもつペプチド配列を発現するファージを結合させた。レセプター・ファージ複合体はヒスチジンタグと特異的に結合するニッケルイオンでコートされたマイクロタイターウエル上に捕獲され、関係のないファージは数回の洗浄で取り除かれた。最後にこの特異的に結合したファージを洗い出し、回収後にその塩基配列を決定することでアンギオテンシンレセプターに結合するペプチド配列を得た。このサイクルを数回くりかえすことでより正確なペプチド配列を得ることができた。
この方法は既存のレセプターのみではなく、今までにそのリガンドが知られていない未知のペプチドレセプターに対しても応用できることが考えられる。また既存のレセプターに対しても今までに知られていない特異的に結合する新しいペプチド配列の探索も可能である。

Research Products

• [Publications] Kumiko Yamaguchi: "Molecular cloning of NPY receptor genes using highly degenerate primers from Fugu rubripes." Journal of Biochemistry,Molecular Biology and Biophysics.(in press). (1998)
• [Publications] Kumiko Yamaguchi: "Calbrain,a novel two EF-hand calcium-binding protein that suppresses Ca^<2+>/calmodulin-dependent protein kinase II activity in the brain." Journal of Biological Chemistry. (in press). (1999)