極めて低電位で機能する新規なエネルギー変換酵素Rnfファミリーの研究

2000 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11440236
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 佐伯 和彦 大阪大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (40201511)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 高橋 康弘 大阪大学, 大学院・理学研究科, 講師 (10154874) ; 福山 恵一 大阪大学, 大学院・理学研究科, 教授 (80032283)
• Keywords: 光合成細菌 / NADH / 膜蛋白質複合体 / 鉄硫黄蛋白質 / 膜配向性

Research Abstract

1.hexaHis標識付加R.複合体の精製条件の検討:C末端にhexaHis配列を付加したRnfBを利用した複合体精製法の検討を行った。窒素固定条件化で培養した菌体から、嫌気性条件下でクロマトフォア膜を調製し、Rnf複合体を含む膜蛋白質を1%(w/v)ドデシルマルトシドで可溶化した。可溶化物をNi-NTAアガロースに吸着させた後、150mMイミダゾールで溶出、溶出物をゲル濾過し、さらにDEAEセファロースによる陰イオン交換クロマトグラフィを行った。ステップが進むにつれて、複合体からのサブユニットの部分的脱離とRnfB自体の変性が進行し、トータルの精製度はむしろ低下した。結晶化を行うためには、より迅速且つ安定な精製法を確立する必要がある。RnfBは不安定であるため、より安定と考える膜貫通サブユニットへの分子標識付加を計画中である。付加位置については2の配向性解析の結果から検討する。
2.RnfEの膜配向性解析:複合体のサブユニットうち、RnfA,RnfDおよびRnfEは疎水性の複数回膜貫通蛋白質である。これらの膜配向性のうちRnfAについては、大腸菌アルカリ性フォスファターゼとの融合により解析済みだが、RnfDについて引き続き精度を上げるとともに、RnfEについても解析を行った。この結果、RnfAとRnfEは相互に相同性を持つにも関わらず、全く逆の膜配向性を持つことがわかった。3つの膜貫通サブユニット同士の相互作用について早急に解析を進める。
3.rnf類似遺伝子群の遺伝解析:大腸菌のrnf類似遺伝子群を完全に破壊するためのプラスミドセットを作製し変異株を作製中である。R.capsulatus rnf遺伝子群周辺領域について塩基配列決定を進めたところ、rnfEの下流に2つのORFが存在することを確認した。これらが窒素固定に必須かどうかを今後検討する。

Research Products

• [Publications] Kazuhiko Saeki: "The Lotus Symbiont, Mesorhizobium loti : Molecular Genetic Techniques and Application"Journal of Plant Research. 113・1112. 457-465 (2000)
• [Publications] Yutaka Oda: "Crystal structure of tobacco necrosis virus at 2.25 Å resolution"Journal of Molecular Biology. 300・1. 153-169 (2000)
• [Publications] Kazuhiko Saeki: "Primary Structure and Phylogenetic Analysis of the Coat Protein of a Toyama Isolate of Tobacco Necrosis Virus"Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 65・3. 719-724 (2001)
• [Publications] Fabio O.Pedrosa: "Nitrogen Fixation : From Molecules to Crop Productivity"Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London. 669 (2000)