2000 Fiscal Year Annual Research Report
DNA複製開始蛋白質DnaAの機能ドメインと高次構造の決定
| Project/Area Number |
11470486
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
土屋 友房 岡山大学, 薬学部, 教授 (80012673)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
増田 和文 岡山大学, 薬学部, 助手 (00243486)
見尾 光庸 岡山大学, 薬学部, 助教授 (70190600)
月原 冨武 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (00032277)
小林 佐賀恵 岡山大学, 薬学部, 助手 (90212654)
水島 徹 岡山大学, 薬学部, 助教授 (00264060)
|
|---|
| Keywords | ORC / ORC / DNA複製 / ATPase / DnaA / 酸性リン脂質 / 機能ドメイン / 結晶構造解析 |
|---|
| Research Abstract |
1 DnaAのX線結晶構造解析
DnaA蛋白質の機能を統合的に理解するために、DnaAのX線結晶構造解析を試みている。結晶化のためには、高い濃度の精製標品が必要である。これまでの精製法では、高い濃度の精製標品を得ることは出来なかったが、これまでのゲル濾過カラムの代わりに、イオン交換カラムを用いることによりそれが可能になることを見出した。
2 DnaAの膜結合部位の決定
我々は既に、DnaAの活性制御に重要な膜結合性の最初の必須アミノ酸として、Lys372を報告している。本年度は、さらに別の必須アミノ酸Arg328を同定した。さらに我々はこれまで未解明であった膜リン脂質によるDnaAからのADP遊離促進機構として、膜リン脂質が、上記の二つのアミノ酸と結合し、その付近の高次構造を変化させ、ADPとの結合に重要な、Arg334がADPと結合できなくするというモデルを提唱した。
3 DnaAのN末端領域の機能解析
我々はこれまでDnaAの種々の活性に預かる機能ドメインの決定を行ってきた。その結果、DnaA同士の相互作用に預かる機能ドメイン以外はすべてその決定に成功した。一方、DnaAのN末端部位の機能も未解明であった。我々はDnaA蛋白質のN末端の疎水性のアミノ酸残基が多くの原核生物でよく保存されていること、及びそのアミノ酸群が、ロイシンジッパー様構造(蛋白質の重合に関与)をとることを発見し、N末端がDnaA蛋白質同士の相互作用に関与していると考え、その証明を目的として研究を行った。その結果、N末端のアミノ酸でDnaAの機能に必須なアミノ酸の同定に成功し、そのアミノ酸に変異を持つDnaAが、DnaA同士の相互作用を出来ないことを見出し、上記の仮説の証明に成功した。
|
-
[Publications] Makise,M.: "Identification of amino acids involved in the functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids."J.Biol.Chem.. 275. 4513-4518 (2000)
-
[Publications] Mizushima,T: "Site-directed mutational analysis of DnaA protein, the initiator of chromosomal DNA replication in E.coli."j.Biochem. (review). 127. 1-7 (2000)
-
[Publications] Mizushima,T: "Cdc6p modulates the structure and DNA binding activity of the Origin Recognition Complex in vitro."Genes & Dev.. 14. 1631-1641 (2000)
-
[Publications] Kondo,T.: "Suppression of temperature-sensitivity of a dnaA46 mutant by higher DNA supercoiling"Biochem.J.. 348. 375-379 (2000)
-
[Publications] Tomisato,W.: "Geranylgeranylacetone protect cultured guinea pig gastric mucosal cells from cytotoxic effect of indomethacin."Dig.Dis.Sci.. 45. 1674-1679 (2000)
-
[Publications] Makise,M.: "Molecular mechanism for functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids ; identification of important amino acids"J.Biol.Chem.. In press. (2001)
