マイクロサテライト領域に関わる国内主要造林樹種育種DNAマーカーの開発

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11556027
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 宝月 岱造 東京大学, アジア生物資源環境研究センター, 教授 (10107170)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小島 克己 東京大学, アジア生物資源環境研究センター, 助教授 (80211895) ; 井出 雄二 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (90213024)
• Keywords: アカマツ / ヒノキ / スギ / マイクロサテライト(SSR) / 抑制PCR / gene walking 法 / 多型解析

Research Abstract

昨年度は、極めて簡便な、ISSR断片を出発点とするマイクロサテライト(SSR)作製方法を考案した。今年度は、昨年度確立した作製方法をさらに発展させ、抑制PCR用アダプターを付けた制限断片を出発とする、より汎用性の高い二段階法を確立した。方法の概要は以下のようである。
(1)一段階目は、ゲノムDNAを一つの制限酵素で切ったのち、制限断片に抑制PCR用アダプターを付け、アダプター付き制限断片ライブラリーを作る。このようなアダプター付き制限ライブラリーを6種の制限酵素について作る。(2)SSR配列を持つプライマーとアダプター配列から設計したプライマーによるPCRによって、他種類の増幅断片を含むPCR産物を得る。(3)サブクローニングし、一端にSSR配列を持つ断片の塩基配列を必要なだけ決定する。(4)SSR隣接配列からプライマーを設計する。(5)二段階目は、設計したプライマーと抑制PCR用アダプタープライマーによって、アダプター付き制限ライブラリー6種をPCR増幅し、適当な大きさの一本のバンドのみを増幅するライブラリーを選び、PCR産物の配列を決定する。(6)配列からSSR両側の配列を決定する。(7)増幅を調べて、SSRマーカーを完成する。
方法の汎用性をチェックするために、ニセアカシア、カンバ類の樹木、数種の外生菌根菌、マツノマダラカミキリ、マツノザイセンチュウを材料にして、SSRマーカーを作製した。その結果、この方法は、これまでに報告されている方法に比べて、極めて容易で時間がかからず、確実性が高く、さらに汎用性が極めて高いことが確認された。

Research Products

• [Publications] Lian C, Zhou Z, Hogetsu T: "A simple method for developing microsatellite markers using amplified fragments of inter-simple sequence repeat (ISSR)"Journal of Plant Research. 114. 381-385 (2001)
• [Publications] Lian C, Hogetsu T: "Development of microsatellite markers in black locust (Robinia pseudoacacia) using a dual-step technique"Molecular Ecology Notes. (in press). (2002)
• [Publications] Kanchanaprayudh J, et al.: "Polymorphic microsatellite markers of Pisolithus spp. from Eucalyptus plantation"Molecular Ecology Notes. (in press). (2002)