破骨細胞形成におよぼすサイトカイン、接着分子の相互作用

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 11671089
• Research Institution: OKAYAMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 井上 勝 岡山大学, 医学部・附属病院, 講師 (20253023)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 弘之 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (80231413) ; 清野 佳紀 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80028620)
• Keywords: 破骨細胞前駆細胞 / 細胞接着 / 信号伝達系 / インテグリン / M-CSF

Research Abstract

細胞が細胞外マトリックスと接触することは、多くの細胞にとって、必須であり、主にインテグリンの介在の上になり立つ。破骨細胞前駆細胞においても、インテグリンα_vβ_5は豊富に発現しており、破骨細胞はその成熟及び機能発現にM-CSFをはじめとする各種サイトカインが必要である。細胞接着因子を介したシグナル伝達系と、増殖因子からのシグナル伝達系には重複するところが多い。このようなことより破骨細胞及びその前駆細胞において2つのシグナル伝達系が関与し合っているのか、そしてその中心となるシグナル伝達物質は何かを同定した。
6週齢のC3Hマウスの大腿骨、脛骨より骨髄細胞を分離、24時間後に非接着分画よりFicoll-hypaque遠心法にて、マクロファージ分画を回収したのち、100mmプラスチックデッシュ上でマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の存在下で10%FBS添加αMEMで3日培養する。この方法により、M-CSF依存性の破骨細胞前駆細胞を得た。細胞をPBSにて2回洗浄、0.1%BSA添加αMEMに変更したのみの対照群と、細胞を剥離、回収した実験群を作成した。実験群は,PFAデッシュで非接着状態で40分培養後、プラスチックデッシュ(A群)、PFAデッシュ(NA群)上でさらに15分培養後、全細胞を回収した2群を作成した。対照群、実験群ともに1%NP-40を含むcell lysis bufferにて細胞を溶解する。SDS-PAGEにてCell lysateを分画した後、Western blotをおこないリン酸化チロシンにたいする抗体を使いECL法にて検討した。対照群に比較してA群、NA群ともにリン酸化チロシンの発現は減少していた。そのなかでも50kDaに相当するバンドはNA群では消失していたが、A群では対照群の60%程度に回復していた。