テロメラーゼ発現制御機構解明とそのプロモーターを利用した癌遺伝子治療の実験的研究

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 12470330
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 並木 幹夫 金沢大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (70155985)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 京 哲 金沢大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (50272969) ; 高 栄哲 金沢大学, 医学部・附属病院, 講師 (90283134) ; 越田 潔 金沢大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (70186667)
• Keywords: テロメラーゼ / 遺伝子治療 / 前立腺癌 / CD遺伝子 / アンドロゲン

Research Abstract

hTERTは,細胞の不死化に関わるテロメラーゼの構成蛋白の一つである.本研究では,申請者らがクローニングしたhTERTのプロモーター領域(1375bp)を利用して,遺伝子治療の基礎的検討を行った.プロモーター領域のdeletion mutantを10種類作製し,各種細胞株におけるプロモーター活性をLuciferase assay法を用いて解析した.その結果,転写開始点から378bP上流までの領域は,コントロールとして用いたSV40プロモーターの約80%の活性を示した.次にこの活性領域の脱メチル化を行い,抑制されていたp16やE-cadherinの発現がメチレーシヨンの関与を受けていることを確認した.さらにPCR-based methylation assayにて,脱メチル化による発現であることを証明した.自殺遺伝子治療に用いられるCD遺伝子を378bpプロモーター下流につなぎ,各種ヒト癌細胞株を用いてin vitro実験を行った.遺伝子導入にはFuGENE6法を用いた.至適濃度の5FCを投与した結果,コントロールとして用いた正常上皮細胞や線維芽細胞では殺細胞効果は認められなかったが,癌細胞株では泌尿器癌だけでなく婦人科癌においても高い殺細胞効果が認められた.さらなる活性増強を目的に,現在この378bpプロモーターをタンデムリピートし,同様の手法で検討中である.in vivoでの治療実験を行うため,378bpプロモーター+CDをアデノウイルスベクターに組み入れた.予備実験として,ex vivoでアデノウイルスによりCD遺伝子を導入した前立腺癌細胞を,SCIDマウスに同所移植後5FCを腹腔内投与した.その結果明かな腫瘍縮少効果が認められた.今後このアデノウイルスベクターをマウス尾静脈から投与し,in vivoでの治療実験を行う予定であるが,上記実験から明かなように,hTERTプロモーターは幅広い癌腫で活性を示すと考えられ,高い抗腫瘍効果が各種癌種で得られるものと期待している.

Research Products

• [Publications] Kitagawa Y, Namiki M, et al.: "Demethylating regent 5-azacytidine inhibits telomerase activity in human prostate cancer cells through trascriptional repression of hTERT"Clin Cancer Res. 6. 2868-2875 (2000)
• [Publications] Kato H, Namiki M, et al.: "Potential benefits of combining cytosine deaminuse/fluorocytosine(CD/5-FC)gene therapy and irradiation for prostate cancer"Int J Urol. (in press). (2002)