酵素触媒機構の理論化学的解明とコバラミン酵素の進化工学的改変並びにコンポジット化

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13125205
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 虎谷 哲夫 岡山大学, 工学部, 教授 (70026318)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久枝 良雄 九州大学, 大学院・工学研究院, 教授 (70150498) ; 山西 守 岡山大学, 工学部, 助手 (30240063) ; 飛松 孝正 岡山大学, 工学部, 助教授 (30188768) ; 吉澤 一成 九州大学, 有機化学基礎研究センター, 教授 (30273486)
• Keywords: ビタミンB_<12>補酵素 / X線構造解析 / ラジカル触媒 / アポ酵素モデル / 理論計算 / 自殺不活性化 / 立体特異性

Research Abstract

1.組換え体グリセロールデヒドラターゼを精製し,その酵素化学的性質を明らかにするとともに、結晶構造解析を行った。1,2-プロパンジオールの反応速度はR体がS体よりも2.5倍速かったのに対して、親和性は同程度であった。酵素がαβγヘテロトリマーの2量体構造をとったり,αとβサブユニットの界面に補酵素が"base-on"構造で結合し,活性中心がαサブユニットの(α/β)_8バレル構造の中に存在し,そこで基質とK^+が複合体を形成しているなど,ジオールデヒドラターゼと高い類似性が見られたが,酵素に結合していたプロパンジオールがR体であるという点では異なっていた。両酵素のグリセロール脱水触媒中の不活性化のされ易さの差異がこの基質結合の特異性により説明可能であることも指摘した。
2.B_<12>補酵素関与酵素には一般に基質がきたときに初めてCo-C結合が開裂するという引き金機構が存在する。この引き金機構を立体構造に基づいて解析した。基質フリー型酵素では、基質の2つの水酸基が占めていた位置に2分子の水がK^+に配位して結合していた。モデリングにより、基質はある程度歪みのかかったCo-C結合にさらに歪みを加えることで、そのホモリシスの引き金を引いていることが強く示唆された。基質結合による局所的コンホメーション変化は決して大きくはないが、コバラミンとβサブユニットとを回転させる結果、増幅されてCo-C結合の歪みを増加させ開裂させると結論された。
3.補酵素B_<12>の下方配位子塩基を置換したアナログを用いてジオールデヒドラターゼ及びエタノールアミンアンモニアリアーゼでの補酵素活性を調べたところ、トリメチレンアナログの結果と同様に塩基の大きさと良く相関しており、また、塩基部のかさ高さが増す程不活性化が起こりにくかった。これらは同じ塩基をもつトリメチレンアナログよりも補酵素活性が高く不活性化も起こりにくかった。ヌクレオチドループの塩基部およびリボース部は反応中間体ラジカルを安定化することに寄与していると考えられる。

Research Products

• [Publications] Eda, M., Kamachi, T., Yoshizawa, K., Toraya, T.: "Theoretical study on the mechanism of catalysis of coenzyme B12-dependent diol dehydratase"Bull. Chem. Soc. Jap.. 75(7). 1469-1481 (2002)
• [Publications] Deshimaru, S., Miyake, Y., Tatsu, Y., Endo, Y., Yumoto, N., Toraya, T., et al.: "cDNA Cloning, Expression, and Properties of the Catalytic Domain of Starfish Cdc25 Dual-specificity Phosphatase, a Cell Cycle Regulator"J. Biochem.-Tokyo. 131(5). 705-712 (2002)
• [Publications] Shibata, N., Masuda, J., Morimoto Y.Yasuoka, N., Toraya, T.: "Substrate-Induced Conformational Change of a Coenzyme B12-Dependent Enzyme: Crystal Structure of the Substrate-Free Form of Diol Dehydratase"Biochemistry. 41(42). 12607-12617 (2002)
• [Publications] Yamanishi, M., Tobimatsu, T., Dokiya, A., Yasuoka, N., Toraya, T., et al.: "The crystal structure of coenzyme B12-dependent glycerol dehydratase in complex with cobalamin and 1,2-propanediol"Eur. J. Biochem.. 269. 4484-4494 (2002)
• [Publications] Fukuoka, M., Yamanishi, M., Zou, X., Brown, L.K., Toraya, T., et al.: "Functions of the D-Ribosyl Moiety and the Lower Axial Ligand of the Nucleotide Loop of Coenzyme B12 in Diol Dehydratase and Ethanolamine Ammonia-lyase Reactions"J. Biochem.. 132(6). 935-943 (2002)
• [Publications] Toraya, T.: "Enzymatic Radical Catalysis: Coenzyme B12-Dependent Diol Dehydratase"The Chemical Records. 2. 352-366 (2002)