ナトリウムポンプの1分子可視化による作動機構と高次構造の解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13142201
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 嘉屋 俊二 北海道大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (90186023)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 谷口 和弥 北海道大学, 大学院・理学研究科, 教授 (40028204) ; 林 雄太郎 杏林大学, 医学部, 教授 (10086556) ; 鈴木 裕 旭川医科大学, 医学部, 教授 (50183421)
• Keywords: ナトリウムポンプ / 蛍光プローブ / 1分子観察

Research Abstract

平成14年度の研究実績
ナトリウムポンプ及びプロトンポンプの分子集合の解析
ポンプ標品の分子集合状態を明らかにするため、エバネッセント光で蛍光標識したポンプ分子の可視化条件を検討した。
FITCによってそれぞれのポンプ分子の触媒サブユニットのATP結合部位に存在するリシン残基にほぼ100%化学修飾を施した。修飾ポンプ標品をC12E8にて可溶化後、超低背景蛍光顕微鏡にて観察し、消光過程を経時的モニターし、解析した。特にプロトンポンプにおいてはさらにn-octylglucosideによる可溶化を行い、C12E8にて可溶化した標品との比較を行った。その結果、1.いずれのポンプ標品においても、FITC標識した酵素分子の蛍光消光の時間経過から量子的な蛍光消光を確認した。また輝点の初期輝度分布から単量体から4量体の多量体構造を確認した。
2.プロトンポンプにおいては、C12E8による可溶化画分は酵素活性を保持していなかったが、n-octylglucosideによる可溶化画分はほぼ活性を保持していた。可溶化画分の蛍光スポットの初期強度分布による多量体度は両者に大きな違いが見られた。C12E8では単量体と2量体が主要成分であるのに対し、n-octylglucosideでは主に2量体と4量体が観察された。
以上の結果はプロトンポンプにおいて、活性を発現する最小機能単位は少なくとも2ないし4量体であることを示唆している。一方、ナトリウムポンプ分子の機能的な多重度解析するために、可溶化条件の詳細を検討する必要がある。
さらに可溶化処理を行わずに蛍光観察が可能なタグを付加したポンプ分子の構築を行った。昆虫細胞系での蛍光性ポンプ分子の発現を現在のところ確認しており、詳細をさらに検討中である。

Research Products

• [Publications] K.Abe: "Gastric H/K-ATPase liberates two moles of Pi from one mole of phosphoenzyme fromed from a high-affinity ATP binding site and one mole of enzyme-bound ATP at the low affinity site during cross-talk between catalytic subunits"Biochemstry. 192・41(2). 2438-2445 (2002)
• [Publications] S.Teramachi: "Single replacement of several amino acid side chain exposed inside of the ATP binding pocket induces different extent of affinity change in the high and low affinity ATP binding sites of rat Na/K-ATPase"J. Biol. Chem.. 277・40. 37394-37400 (2002)
• [Publications] N.Fujitani: "Structure determination and Conformational change induced by tyrosine phosphorylation of the N-terminal domain of the α-chain of pig gastric H^+/K^+-ATPase"Biochem. Biopys. Res. Commun.. 3・300(1). 223-229 (2003)
• [Publications] K.Abe: "K^+ induced simultaneous liberation of two moles of Pi, one from one mole of EP and the other from EATP, of oligomeric H/K-ATPase from pig stomach"Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986(印刷中). (2003)
• [Publications] S.Kaya: "Oligomeric structure of P-type ATPases observed by single molecule detection technique"Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986(印刷中). (2003)