ヘムペプチドを用いた高一酸化窒素スピントラップ分子の創成

2001 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660101
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 奥 忠武 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20059637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河内 隆 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (70339290) ; 西尾 俊幸 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (10256836)
• Keywords: ヘムペプチド / シトクロム / ウマ心筋 / 紅藻スサビノリ / タンパク質水解 / NO捕捉 / 立体構造 / 発現

Research Abstract

(1)シトクロムからヘムペプチドの調製とアミノ酸配列の決定(担当、奥、河内)
シトクロムcはウマ心筋を、シトクロムc_6は紅藻スサビノリを用い、ペプチド数の異なるヘムペプチドの調製を行った。シトクロムのタンパク質部分は、トリプシンやキモトリプシンおよび臭化シアンを作用させ水解した。目的ヘムペプチドを硫酸アンモニウムによる塩析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより調製した。電気泳動およびアミノ酸配列分析の結果から、ウマ心筋シトクロムcから調製したヘムペプチドは、それぞれアミノ酸9残基(1.5kDa)、22残基(3kDa)、65残基(8kDa)であり、紅藻スサビノリシトクロムc_6からは、アミノ酸15残基(2kDa)の合計4種のヘムペプチドの調製に成功した。
(2)調製ヘムペプチドのNOトラップ能の検討(担当、奥、西尾)
上記で調製した4種ヘムペプチドのNO捕捉能について検討を行った結果、ペプチド鎖の短いヘムペプチド(分子質量の小さい分子)ほど高活性を示した。ウマ心筋シトクロムcの中で最も高活性を示したアミノ酸9残基(1.5kDa)のヘムペプチドは、水解前のアミノ酸104残基から成る天然シトクロムc(12.5kDa)の約100倍のNO捕捉能を示した。また、紅藻スサビノリシトクロムc_6由来アミノ酸15残基のヘムペプチド(2kDa)は、ウマ心筋シトクロムc由来アミノ酸9残基ヘムペプチド(1.5kDa)の約2倍の活性を示した。
紅藻スサビノリシトクロムc_6の立体構造は、1.57Aの解像度で解析に成功している。また、同シトクロムc_6の大腸菌での発現系を構築した。今後、この組換えシトクロムc_6を用いて、より高機能ヘムペプチドの調製を行い、14年以降に用いるヘムペプチドを決定する。