ヘムペプチドを用いた高一酸化窒素スピントラップ分子の創成

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 13660101
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 奥 忠武 日本大学, 生物資源科学部, 教授 (20059637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 河内 隆 日本大学, 生物資源科学部, 助手 (70339290) ; 西尾 俊幸 日本大学, 生物資源科学部, 助教授 (10256836)
• Keywords: ヘムペプチド / シトクロム / 紅藻スサビノリ / 大腸菌 / 発現 / ペプチド精製 / NOトラップ能 / 物理化学的性質

Research Abstract

[1]ヘムペプチドの大腸菌・酵母・枯草菌での発現系の検討(担当、奥、河内)
(1-1)ヘムペプチド遺伝子の発現系の検討
紅藻スサビノリ(P. Yezoensis)由来シトクロムc_6の塩基配列を鋳型として、PCRを行った。構築したpET22b(+)と大腸菌MC1061株よりクローニングしたシトクロムc成熟化酵素遺伝子群(ccmA-H)を挿入したpSTV28ccmA-Hを、大腸菌BL21(DE3)に同時形質転換した。P. Yezoensi由来シトクロムc_6(4本のαヘリックスから構成)のヘリックスII以降を欠損させたHP32(32残基)、ヘリックスIII以降を欠損させたHP43(43残基)、ヘリックスIV以降を欠損させたHP66(66残基)の発現を試みた。第6配位子であるメチオニン58以降を欠損させたHP57(57残基)の計4サンプルの大腸菌での発現に成功した。
(1-2)大腸菌でのヘムペプチド発現と精製
発現HPは、塩析、各種クロマトグラフィーにより精製した。HP32、HP43は、発現を確認出来なかったが、HP57(発現量0.7mg/L)、HP66(1.5mg/L)では発現させることができた。
[2]ヘムペプチドのNOトラップ能と物理化学的性質(担当、奥、西尾)
HP57、HR56のNOトラップ能について検討した結果、両者ともNativeシトクロムc_6に比べ、高いトラップ能を示した。また、413,522,552nmに吸収極大を示し、HP57、HP66両者で差は認められなかった。NOトラップの反応速度論的解析、NOの検出限界、Redox Potential、安定性については解析中である。また、大量発現系についてもさらに検討していく計画である。
これまでCタイプヘムを有するペプチドを大腸菌で発現させた報告はなく、本研究が最初の成功例である。

Research Products

• [Publications] Oku, T., et al.: "Increasing the conformational stability by replacement of heme axial ligand in c-type cytochrome"FEBS Letters. 531(11). 543-547 (2002)
• [Publications] Oku, T., et al.: "Appearance of Nitrite Reducing Activity of Cytochrome c upon Heat Denaturation"Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66(10). 2044-2051 (2002)