2003 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
13670031
|
|---|
| Research Institution | Kansai Medical University |
|---|
Principal Investigator |
渡辺 淳 関西医科大学, 医学部, 助教授 (40148557)
|
|---|
| Keywords | arylhydrocarbon receptor / HSP90 / 転写調節 / 細胞内輸送 / メチルコランスレン / CYP1A1 / ラット / 肝 |
|---|
| Research Abstract |
1)AhRのカルボキシル基末端に蛍光色素Cy5標識抗HSP90抗体およびCy3標識抗AhR抗体で肝の切片を二重染色後、レーザー顕微鏡でHSP90、AhRの局在を記録した。コントロール群ではAhRとHSP90は細胞質の同一部位に検出され、蛍光はほとんど重なった。この結果は、HSP90とAhRが細胞質においてヘテロダイマーを形成しているという仮説を支持する。しかしながらFLET法による確認を試みたところ、タイトな分子結合による蛍光の減衰は著明でなく、両分子の結合がルースであるか、または間に別の物質が介在する可能性が示された。メチルコランスレン(3MC)投与群ではHSP90は細胞質に残存し、AhRは核に移行した。しかしながら、細胞質におけるHSP90の蛍光強度は一時的にコントロール群の約30%程度またはそれ以下に減弱し、AhRと解離した後に構造が変化したか、または他の物質がHSP90抗体が認識するエピトープ付近に結合している可能性が示された。
2)この手法を、我々が発見した内分泌細胞に特異的に発現する新規蛋白群に応用し、この蛋白のひとつ(ユビキチンリガーゼファミリーに属する)の細胞内局在の解明に成功した(論文印刷中)。
3)CYP1A1 genomic DNAの5'-flankingフラグメントと転写調節因子とを、プロモータ制御因子(Sp1,CBP/p-300)の存在下または非存在下で反応させ、DNA構造の変化を原子間力顕微鏡で観察したが、アーティファクトの除外が困難であったため、著明な変化を観察することができなかった。
4)CYP1A1 genomic DNAの5'フラグメントに発光レポーター(luciferase)遺伝子のcDNAを繋いだハイブリッドDNAを作成し、このハイブリッドDNAとXRE結合蛋白とを、プロモータ制御因子の存在下または非存在下で反応させ、転写因子結合後の転写活性をフォトンとして捉えることでシングルコピー遺伝子レベルの転写活性の検出を試みた。反応をwellまたはnylon膜でおこなった場合、10コピー程度のレベルであれば検出可能であった。しかしながら、このハイブリッドDNAを用いたin situ Southwestern hybridizationは成功するに至らなかった。
|
