2013 Fiscal Year Annual Research Report
糖鎖プロセシング酵素と相同性を有する酵素の立体構造解析に基づく新規オリゴ糖の創出
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13J07279
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
宮崎 剛亜 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 特別研究員PD
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| Keywords | N結合型糖鎖 / 糖質加水分解酵素 / オリゴ糖 / X線結晶構造解析 |
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| Research Abstract |
N結合型糖鎖は真核生物において重要な生理的機能を担っており、糖鎖プロセシングの最初にはたらく酵素としてプロセシングα-グルコシダーゼIが知られている。一方、真正細菌は真核生物型の糖鎖を産生しないが、本酵素と同じ糖質加水分解酵素ファミリー63(GH63)に属する機能未知タンパク質の遺伝子が真正細菌においても見出されている。本研究では、真正細菌由来GH63タンパク質および真核生物プロセシングα-グルコシダーゼIの構造機能相関の解明および、それらを利用した新規なオリゴ糖の作出やN結吉合型糖鎖の部分的合成を目的とした。
大腸菌由来GH63酵素YgjKをグライコシンターゼ変異体E727Aと合成したオリゴ糖Glcα-1,2-Galとの複合体構造解析により、Glcα-1,2-GalがYgjKの活性部位に結合すると複数のアミノ酸残基の構造が変化し、触媒ドメインが閉じる構造をとることがわかった。野生型酵素はGlcα-1,2-Ga1を加水分解することから、YgjKは天然においてコラーゲンなどに見出される糖鎖構造であるGlcα-1,2-Ga1を分解する酵素である可能性が考えられた。本成果はFEBS Journalにおいて発表した。また、触媒残基を他のアミノ酸に置換しグライコシンターゼ活性を獲得した変異体を新たに作製した。
糸状菌Aspergillus basiliensis ATCC 9642由来プロセシングα-グルコシダーゼI(AbPGI)のX線結晶構造解析を行うため、Hisタグ融合タンパク質として大腸菌を用いて発現させた。精製した酵素を用いて結晶化条件のスクリーニングを行ったところ、単結晶を得ることに成功した。高エネルギー加速器研究機構の放射光科学研究施設にてX線回折強度測定を行った結果、3.4Å分解能の回折データを得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
大腸菌由来機能未知酵素YgjKについては、オリゴ糖合成に加え、本酵素の機能に関する新たな知見を得ることができ、国際学術誌に論文として発表することができた。またAbPGIについては当初の計画通り、結晶化およびX線回折強度測定を行うまでに至っている。ゆえに、本研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Glcα-1,2-Galの収率向上を目的とし、昨年度行った立体構造解析から新たに明らかになった反応に里要なアミノ酸残基に変異を導入し、新たなグライコシンターゼ変異体の作製を行う。得られた変異体を用いて反応の定量的解析を行い、各反応効率の評価を行う。AbPGIは結晶の分解能向上を目的とし、結晶化条件のスクリーニングやX線回折強度測定の条件検討等を行う。また、YgjKグライコシンターゼより得られた知見をもとに、AbPGIのグライコシンターゼ化を行い、N結合型糖鎖の部分構造の合成を目指す。
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[Journal Article] Enhancing thermostability and the structural characterization of Microbacterium saccharophilum K-1 β-fructofuranosidase.2014
Author(s)
Yukari Ohta, Yuji Hatada, Yuko Hidaka, Yasuhiro Shimane, Keiko Usui, Tetsuya Ito, Koki Fujita, Gaku Yokoi, Marina Mori, Shona Sato, Takatsugu Miyazaki, Atsushi Nishikawa and Takashi Tonozuka
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Journal Title
Applied Microbiology and Biotechnology
Volume: (in press)
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Microbacterium saccharophilum K-1由来β-フルクトフラノシダーゼ耐熱化酵素の立体構造解析2014
Author(s)
盛 まりな, 横井 岳, 佐藤 祥名, 宮崎 剛亜, 大田 ゆかり, 嶋根 康弘, 秦田 勇二, 藤田 孝輝, 伊藤 哲也, 西河 淳, 殿塚 隆史
Organizer
日本農芸化学会2014年度大会
Place of Presentation
明治大学生田キャンパス(神奈川県川崎市)
Year and Date
2014-03-28
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