バイオイメージングによるアセチルコリン合成酵素の細胞内機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15500257
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 松尾 明典 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 助手 (20324585)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 相見 良成 滋賀医科大学, 分子神経科学研究センター, 助手 (20231756) ; 斎藤 尚亮 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (60178499)
• Keywords: pChAT / cChAT / GFP / トランスロケーション / リン酸化

Research Abstract

培養細胞系でGFP融合pCHATおよびcChATを設計、発現させることに成功した。CHO、COS-K1およびHEK-293で発現状況を検討した結果、凝塊を生じないHEK-293細胞がもっとも観察に適していた。一時的発現に続いて、pChAT-GFP、cChAT-GFPの安定発現株の確立にも成功した。アセチルコリン合成酵素活性については、cChAT-GFPで十分な活性を有していることを確認し、設計したコンストラクトがアセチルコリン合成能を保有しうることが証明された。酵素活性が低いと予想されたpChATでは、pChAT-GFPの酵素活性も低値であるが、コファクターによって賦活される可能性があり、いくつかの候補について検証中である。標識する蛍光物質の種類および位置ついても検討を加え、GFPを反対側に融合したGFP-pChAT, GFP-cChATの発現にも成功した。多重観察に備えて、長波長蛍光を発するHcRed融合タンパクによる一時発現にも成功した。
確立した安定細胞株を用いて培養細胞内pChATおよびcChATの局在と動態の解析を共焦点レーザー下で行った結果、定常状態では、pChAT-GFPは細胞質のみ、cChAT-GFPは細胞質および核内に存在することが明らかになった。核外移行シグナル阻害物質による処理で、pChAT-GFPが核内にも移行しうることも確認した。種々の薬剤による刺激の結果、pChAT-GFPの細胞内トランスロケーションは主としてリン酸化酵素の修飾によって引き起こされていることが観察された。具体的には、PKCを刺激すると細胞内、阻害すると核内へ移行する傾向があることがわかった。pChAT-GFPとcChAT-HcRedを用いて同時発光にも成功した。後根神経節を用いた初代培養神経細胞について予備実験を行い、トランスフェクションの準備も行っている。

Research Products

• [Publications] Yasuhara O., Tooyama I., Aimi Y., Bellier JP., Hisano T., Matsuo A., Park M., Kimura H: "Demonstration of cholinergic ganglion cells in rat retina : expression of an alternative splice variant of choline acetyltransferase"Journal of Neuroscience. 23・7. 2872-2881 (2003)
• [Publications] Iwami I, Tooyama I, Kinoshita A, Matsuo A., Oomura Y., Sasaki K., Kimura H.: "Demonstration of fibloblast growth factor-1 in rat adreanal gland as revealed by reverse transcription-polymerase chain reaction and immunohistochemistry"Acta Histochemistry and Cytochemistry. 36・4. 353-359 (2003)
• [Publications] 遠山育夫, 松尾明典, 安原治: "痴呆症学(2)高齢社会と脳科学の進歩 臨床編 各論 II.神経変性疾患による痴呆(変性性痴呆)Alzheimer病 孤発性Alzheimer病 遺伝的因子"日本臨床. 62・増刊号1. 46-51 (2003)
• [Publications] Uchino M, Sakai N, Kashiwagi K, Shirai, Y, Shinohara Y, Hirose K, Iino M, Yamamura T., Saito N.: "Isoform-specific phosphorylation of mGluR5 by PKC blocks Ca2+ oscillation and oscillatory translocation of Ca2+-dependent PKC"Journal of Biological Chemistry. 279・3. 2254-2261 (2004)
• [Publications] Sasaki A, Taketomi T, Kato R, Saeki K, Nonami A, Sasaki M, Kuriyama M, Saito N, Shibuya M, Yoshimura A.: "Mammalian Sprouty4 suppresses Ras-independent ERK activation by binding to Raf1"Nature Cell Biology. 5・5. 427-432 (2003)
• [Publications] Fredholm B.B, Assender J.W., Irenius E, Kodama N, Saito N.: "Synergistic effects of adenosineA1 and P2Y receptor stimulation on calcium mobilization and PKC translocation in DDT1 MF-2 cells"Cellular and Molecular Neurobiology. 23・3. 379-400 (2003)
• [Publications] Saito N.: "Fluorescent imaging of Protein kinase C Translocation. In "Protein kinase C Protocols""edited by Newton A.C. Humana Press. 12 (2003)