2004 Fiscal Year Annual Research Report
高感度酸素絶対測定による組織や細菌の薬剤感受性検査法の開発
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15590485
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| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
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Principal Investigator |
石田 哲夫 滋賀医科大学, 医学部, 助教授 (10176191)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田中 裕之 滋賀医科大学, 医学部, 助手 (10293820)
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| Keywords | 酵素カラム / 酸素濃度測定 / 酸素添加酵素 / 微量酸素 / カテコール / 還流実験 / シリンジポンプ / 酵素の安定化 |
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| Research Abstract |
本研究は、酸素添加酵素のメタピロカテカーゼ(Mpc)とその基質の4-クロロカテコール(4CC)とからなる超高感度酸素分子絶対測定系を組織や細菌の酸素消費速度の定量的測定に応用し、薬物の有効性や毒性・抗生物質感受性の迅速な定量方法を開発することを目指している。平成16年度は、以下の成果を得た。
1.(酵素カラムの作成)強い活性を持ち、長期間安定に保存可能で、再活性化が可能なMpc固定化法を確立した。pH8.0で、非常に強い拮抗阻害剤である2-ヒドロキシピリジンN-オキシド(2HPNO)存在下で活性化担体(トヨパールやセファロース)と反応させることで、90%以上の効率で1mlのゲル当たり10〜20mgのMpcを固定化できた。これらの固定化酵素はバルクでも反復使用・回収が可能である。
2.(酸素濃度ゼロ緩衝液供給系の作成)4CCはC18やPhenyl基を固定化した逆相系樹脂で、酵素反応生成物の5-クロロ-2-ヒドロキシムコン酸セミアルデヒド(CHMSA)は強アニオン交換樹脂で効率よくトラップできることが分かった。緩衝液に1mMの4CCと触媒量のMpcとを加えてシリンジに封入し、2者をタンデムに充填したトラップカラムを通してシリンジポンプで送液することにより、酸素濃度ゼロの緩衝液を簡単に供給できるようになった。これにより、任意の酸素濃度の緩衝液を反応槽に送液する技術が実現した。
3.(酸素濃度の連続測定系)1.で作成したMpc固定化樹脂を充填したカラムは強い安定した酵素活性を示した。反応槽からの溶出液にCHMSAだけのトラップカラムを通した酸素ゼロの4CC溶液(2.参照)を混合した後、本カラムを通して検出器に導くことで、酸素濃度の連続測定が可能なことを実証できた。
4.(Mpc-2HPNOの結晶構造解析)Mpc-2HPNO複合体の結晶構造解析可能な柱状結晶が再現性よく得られた。
本研究で、酸素濃度を制御した還流測定の要素技術をほぼ確立できた。反応容器の作成が今後の課題である。
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