2016 Fiscal Year Annual Research Report
グライコプロテオームを中心とした複合オミクス解析による疾患モデルの糖鎖機能解析
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15H01841
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
成松 久 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 総括研究主幹 (40129581)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
安形 清彦 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 招聘研究員 (00611138)
栂谷内 晶 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 主任研究員 (60392635)
梶 裕之 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 研究グループ長 (80214302)
佐藤 隆 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 創薬基盤研究部門, 主任研究員 (90371046)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 糖鎖 / 糖転移酵素 / 糖タンパク質 / 糖ペプチド / 糖鎖機能 / グライコプロテオーム解析 / グライコーム解析 / トランスクリプトーム解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では、各糖転移酵素特異的な標的タンパク質の大規模同定を行うために、糖転移酵素遺伝子ノックアウト(KO)マウス群を用い、糖鎖キャリア分子（糖ペプチド）をレクチン捕集して、野生型とKOマウスとの比較グライコプロテオーム解析を行っている。まずは、Lewis x構造（Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc-R）を合成する、α1,3-フコース転移酵素9（Fut9）に着目し、Fut9 KOマウスを用いた解析を行った。昨年度の腎臓に引き続き、脳組織を使用してグライコプロテオーム解析によるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質および糖鎖構造の（野生型とKOマウスとの）比較解析を行なった。脳グライコームを分析し比較した結果、WTでは複数のフコースを持つ糖鎖(一つ以上のルイス型フコース)があり、多くの糖鎖にシアル酸が付加されていた。
また、2型のLacdiNAc糖鎖の生合成に関与する酵素であるB4GALNT3、B4GALNT4遺伝子の欠損マウスあるいは細胞株を用いてグライコプロテオミクス解析によるLacdiNAc-omicsを遂行し、そのキャリアタンパク質候補の同定と解析を行った。同じく1型のLacdiNAc糖鎖の生合成に関連するB3galnt2 KOマウスは胎生致死のため、交配し発生時期毎に胎仔マウスを取得し、重量測定、遺伝子型解析、一次培養、組織染色などを実施した。モデル細胞を用いてグライコプロテオーム解析を行った結果、キャリアタンパク質候補の同定に成功した。
以上のように、新たなグライコプロテオミクス解析によって各種糖鎖キャリアが同定されたので、表現型との関連を解析することで、糖鎖の生体内機能を明らかにすることができると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではグライコプロテオームを中心とした複合オミクスの解析により、ノックアウトマウス（疾患モデルマウス）や改変細胞を用いて糖鎖構造及び糖鎖遺伝子の機能解明を目指している。これまでに、基本解析技術・手順を確立し、標的キャリア本研究ではグライコプロテオームを中心とした複合オミクスの解析により、ノックアウトマウス（疾患モデルマウス）や改変細胞を用いて糖鎖構造及び糖鎖遺伝子の機能解明を目指している。これまでに、基本解析技術・手順を確立し、標的キャリア糖タンパク質を効率良く捕集するためのレクチンの選定と、その捕集系の構築、最適条件を検討する作業を進めてきた。当該年度に新たに開発したグライコプロテオーム解析技術・ツール（Glyco-RIDGE法）を用いて、糖鎖キャリア分子を網羅的・ハイスループットに同定するための系の構築のモデルとして、まずは糖転移酵素Fut9について実証実験を進め、腎臓におけるルイスx糖鎖のキャリアタンパク質の同定に成功し、引き続き他の糖転移酵素B4galnt3(4)、B3ganlnt2、B3gnt2、B3gnt6等の糖鎖遺伝子KOマウスあるいはCRISPR/Cas9システムによる糖鎖遺伝子KO細胞を用いて、糖鎖のキャリアタンパク質同定を進めている。糖鎖遺伝子の発現の異なる細胞で次世代シーケンサーによるトランスクリプトーム解析も実施し、グライコプロテオームの解析結果との統合、およびパスウェイ解析を進めた。以上のように当該年度の研究計画は順調に進んでいる。今後は統合的に得られる情報を元に機能との関連について解析を進めていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
疾患モデルマウスの解析と並行して単純化した糖鎖改変細胞を構築して糖鎖機能の解析を行う。IGOT-LC/MS法ならびにGlyco-RIDGE法を用いてキャリア分子と糖鎖構造の変化を同時に同定するなどグライコプロテオーム解析を進めるほか、必要に応じて糖鎖構造解析なども行う。
ノックアウトマウス個体において観察された表現型や応答との関連を明らかにするために、グライコプロテオーム解析とトランスクリプトーム解析から得られるオミクスデータを統合し、データベース・ソフトウェアなどの分子ネットワーク情報を利用してパスウェイ解析などを行うことで、生物機能に関連する糖鎖キャリアタンパク質を絞り込み、特定の糖鎖構造の消失やネオエピトープの増加による生体機能への影響を解析する。解析結果から予測される相互作用因子や刺激等によって、応答の生化学的解析を行うとともに、結果を疾患モデルマウスへとフィードバックして詳細な疾患メカニズムの解析の基礎情報とする。
また、本課題の網羅的なグライコプロテオミクス解析により得られた標的糖タンパク質分子のデータ（糖ペプチド配列、糖鎖付加位置）については論文などによる公開のほか、将来的にはデータベース化なども進め、広く公開することで次世代の糖鎖研究の基盤としたいと考えている。
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[Presentation] 腎糸球体足細胞におけるムチン型糖鎖の役割2016
Author(s)
布施谷清香, 岡田理沙, 鈴木陸, 新保未来, 涌井宏優, 臼井俊明, 森戸直記, 萩原梢, 佐藤隆, 成松久, 高橋智, 工藤崇
Organizer
第３９回日本分子生物学会年会
Place of Presentation
パシフィコ横浜（神奈川県横浜市）
Year and Date
2016-11-28
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[Presentation] 佐藤隆, 梶裕之, 千葉靖典, 成松久2016
Author(s)
Characterization of Wisteria Floribunda lectin and Its Application for Glycoproteomics Study
Organizer
8th Asian Community of Glycoscience and Glycotechnology
Place of Presentation
Jiangnan University (Wuxi, China)
Year and Date
2016-10-14
Int'l Joint Research / Invited
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[Presentation] 糖タンパク質の糖鎖不均一性の大規模解析2016
Author(s)
梶 裕之, 富岡あづさ, 野呂絵里花, 藤田弥佳, 助川昌子, 岡谷千晶, 鹿内俊秀, 成松久
Organizer
第89回日本生化学会大会
Place of Presentation
仙台国際センター／東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
Year and Date
2016-09-27
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[Book] A Practical Guide to Using Glycomics Databases：GlycoGene Database (GGDB) on the Semantic Web.2016
Author(s)
成松久, 鈴木芳典, 木下フローラ聖子, 鹿内俊秀, 藤田典昭, 佐藤隆, 栂谷内晶, 横尾岳彦, 安形清彦, 久保田智巳, 野呂絵里花
Total Pages
13
Publisher
Springer
