トランスポゾンを用いた遺伝子トラップに基づく新しい生命科学研究の基盤創成

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 15H02370
• Research Institution: National Institute of Genetics
• Principal Investigator: 川上 浩一 国立遺伝学研究所, 個体遺伝研究系, 教授 (70195048)
• Project Period (FY): 2015-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ゲノム / 遺伝学 / 遺伝子 / 神経科学 / 発生・分化 / ゼブラフィッシュ / 器官形成

Outline of Annual Research Achievements

（１）ゼブラフィッシュにおいて、Gal4を組み込んだ遺伝子トラップ型トランスポゾンコンストラクトをゲノムにランダムに組み込ませ、細胞・組織・器官特異的にGal4を発現するトランスジェニックフィッシュの大規模スクリーニングを実施し、新規に120系統を同定した。これらフィッシュ系統のサザンブロット解析、インバースPCR等分子生物学的解析を行うことにより、トランスポゾン挿入部位を決定した。これら発現パターン、ゲノム情報をデータベースzTrap上で閲覧・検索可能にした。
（２）上述のトランスジェニックフィッシュを用いて、以下の共同研究を実施した。神経細胞分化におけるニューレグリンーErbBシグナル経路の役割（京大瀬原博士）。側線神経細胞損傷後の修復過程の可視化（ドイツ　Lopez-Schier博士）。神経軸索の枝分かれのメカニズムの解明（フランス　Del Bene博士）。松果体の新規オプシン分子の機能解明（大阪市立大寺北博士）。糖尿病関連遺伝子FTO近傍のエンハンサー解析（オーストラリア　Becker博士）。モヤモヤ病原因遺伝子の機能解析（京産大永田博士）。血管内皮細胞のカルシウムイメージング（国立循環器病研究センター望月博士）。脳脊髄液接触神経細胞の運動における役割（フランス脳脊髄研究所Wyart博士）。カルシウムシグナルデータの解析システムの開発（国立情報研北本博士）。これらの研究成果を英文論文９報として発表した。
（３）トランスジェニックフィッシュ349系統の成体の脳を解析し、脳の様々な領域でGal4を特異的に発現する系統を77系統同定することに成功した。また恐怖条件付け学習のアッセイシステムの構築に成功した。Gal4発現フィッシュ系統を用いて神経毒素を特異的な神経細胞に発現させ、それらの機能を阻害し行動解析実験を行うことにより、恐怖条件付け学習に必須な脳神経回路の同定に成功した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

（１）細胞・組織・器官特異的にGal4を発現するトランスジェニックフィッシュを選別する大規模スクリーニングを実施し、新規に120系統を作製することができたから。（当初予定は100系統）
（２）国内外の研究者との共同研究の成果として査読付き英文論文９報を発表することができたから。またトランスポソンテクノロジーを哺乳動物細胞、ニワトリで用いた関連英文論文２報を発表することができたから。
（３）トランスジェニックフィッシュ系統349系統から、脳の様々な領域でGal4を特異的に発現するフィッシュ系統を77系統同定することに成功し、ゼブラフィッシュを用いて行動と機能的神経回路を研究するための基盤を構築することができたから。

Strategy for Future Research Activity

（１）モデル脊椎動物ゼブラフィッシュにおいて、Tol2を用いた遺伝子トラップコンストラクトをもつプラスミドDNAを、転移酵素mRNAとともに受精卵にインジェクションし、細胞・組織・器官特異的に改変型酵母転写因子Gal4FFを発現するトランスジェニックフィッシュを新規に樹立する研究を継続する。さらにこれらトランスジェニックフィッシュのサザンブロット解析、インバースPCRによるTol2挿入部位近傍のゲノムDNAの解析を進め挿入部位を決定する。これらの発現情報、遺伝子情報をとりこんだデータベースを整備・発展させる。
（２）細胞・組織・器官特異的にGal4を発現するトランスジェニックフィッシュを基にした共同研究のさらなる展開・発展をはかる。連携研究者：石谷太（群馬大、脳、消化器官、Wntシグナル）、伊藤素行（千葉大、Notchシグナル、神経発生）、稲垣直之（奈良先端大、神経発生、軸索伸長）、小椋利彦（東北大、心臓形成）、川上厚志（東工大、ヒレの再生・形成）、瀬原敦子（京都大、筋肉・腱組織）、田村宏治（東北大、付属肢（ヒレ）の発生と再生）、東島眞一（岡崎統合バイオ、脊髄神経回路）、平田普三（青山学院大、運動システム）、弥益恭（埼玉大、脳原基の領域化と脳機能発達）、山本直行（名古屋大、感覚神経路）、日比正彦（名古屋大、小脳）、藤田深里（神奈川大、血管形成）、およびその他の国内外の研究者と共同研究を推進する。
（３）トランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いて、中枢神経系におけるGal4の発現パターン解析を継続して行い、特定の脳神経回路にGal4を発現するトランスジェニックフィッシュ系統の同定を推進する。これらを基にして、神経細胞の活動の可視化、機能阻害を可能にし脊椎動物の記憶・学習等複雑な行動を司る脳神経回路機能を解析するための新しい基盤を構築する研究を推進する。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Institut du Cerveau/CNRS UMR 7622/Institut Curie(France)
  • Country Name: France
  • Counterpart Institution: Institut du Cerveau/CNRS UMR 7622/Institut Curie
• [Int'l Joint Research] University of Sydney(Australia)
  • Country Name: Australia
  • Counterpart Institution: University of Sydney
• [Int'l Joint Research] Helmholtz Zentrum(Germany)
  • Country Name: Germany
  • Counterpart Institution: Helmholtz Zentrum
• [Journal Article] Chromatin-prebound Crm1 recruits Nup98-HoxA9 fusion to induce aberrant expression of Hox cluster genes (2016)
  • Author(s): Oka, M., Mura, S., Yamada, K., Sangel, P., Hirata, S., Maehara, K., Kawakami, K., Tachibana, T., Ohkawa, Y., Kimura, H., and Yoneda, Y.
  • Journal Title: eLife Volume: 5 Pages: e09540
  • DOI: 10.7554/eLife.09540
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] CSF-contacting neurons regulate locomotion by relaying mechanical stimuli to spinal circuits (2016)
  • Author(s): Bohm, U.L., Prendergast, A., Djenoune, L., Figueiredo, S.N., Gomez, J., Stokes, C., Kaiser, S., Suster, M., Kawakami, K., Charpentier, M., Concordet, J.-P., Rio, J.-P., Del Bene, F., and Wyart, C.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 7 Pages: 10866
  • DOI: 10.1038/ncomms10866
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neuregulin 1 type II-ErbB signaling promotes cell divisions generating neurons from neural progenitor cells in the developing zebrafish brain (2015)
  • Author(s): Sato, T., Sato, F., Kamezaki, A., Sakaguchi, K., Tanigome, R., Kawakami, K., and Sehara-Fujisawa, A.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: e0127360
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0127360
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High-resolution live imaging reveals axon-glia interactions during peripheral nerve injury and repair (2015)
  • Author(s): Xiao, Y., Faucherre, A., Pola-Morell, L., Heddleston, J.M., Liu, T.-L., Chew, T.-L., Sato, F., Sehara-Fujisawa, A., Kawakami, K., and Lopez-Schier, H.
  • Journal Title: Disease Models & Mechanisms Volume: 4 Pages: dmm.018184
  • DOI: 10.1242/dmm.018184
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Deletion of a kinesin I motor unmasks a mechanism of homeostatic branching control by neurotrophin-3 (2015)
  • Author(s): Auer, T.O., Xiao, T., Bercier, V., Gebhardt, C., Duroure, K., Concordet, J.-P., Wyart, C., Suster, M., Kawakami, K., Wittbrodt, J., Baier, H., and Del Bene, F.
  • Journal Title: eLife Volume: 4 Pages: e05061
  • DOI: 10.7554/eLife.05061
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Deubiquitinating enzymes regulate Hes1 stability and neuronal differentiation (2015)
  • Author(s): Taeko Kobayashi, T., Iwamoto, Y., Takashima, K., Isomura, A., Kosodo, Y., Kawakami, K., Nishioka, T., Kaibuchi, K., and Kageyama, R.
  • Journal Title: FEBS Journal Volume: 282 Pages: 2411-2423
  • DOI: 10.1111/febs.13290
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] NAS: Neuron Analyzer Suite for automatic analysis of neuronal activities from calcium imaging data. (2015)
  • Author(s): Hamed, M,, Odul, J., Miller, A.S., Kawakami, K., and Asanobu, K.
  • Journal Title: International Journal of Pharma Medicine and Biological Sciences Volume: 4 Pages: 167-170
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Diversification of non-visual photopigment parapinopsin in spectral sensitivity for diverse pineal functions (2015)
  • Author(s): Koyanagi, M., Wada, S., Kawano-Yamashita, E., Hara, Y., Kuraku, S., Kosaka, S., Kawakami, K., Tamotsu, S., Tsukamoto, H., Shichida, Y., and Terakita, A.
  • Journal Title: BMC Biology Volume: 13 Pages: 73
  • DOI: 10.1186/s12915-015-0174-9
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] BAC transgenic zebrafish reveal hypothalamic enhancer activity around obesity associated SNP rs9939609 within the human FTO gene (2015)
  • Author(s): Rinkwitz, S., Geng, F.-S., Manning, E., Suster, M., Kawakami, K., and Becker, T.S.
  • Journal Title: Genesis Volume: 53 Pages: 640-651
  • DOI: 10.1002/dvg.22884
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Stable and bicistronic expression of two genes in somite- and lateral plate-derived tissues to study chick limb development (2015)
  • Author(s): Bourgeois, A., de Lima, J.E., Charvet, B., Kawakami, K., Stricker, S., and Duprez, D.
  • Journal Title: BMC Developmental Biology Volume: 15 Pages: 39
  • DOI: 10.1186/s12861-015-0088-3
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Neuromuscular regulation in zebrafish by a large AAA+ ATPase/ubiquitin ligase, mysterin/RNF213 (2015)
  • Author(s): Kotani, Y., Morito, D., Yamazaki, S., Ogino, K., Kawakami, K., Takashima, S., Hirata, H., and Nagata, K.
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 5 Pages: 16161
  • DOI: 10.1038/srep16161
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Endothelial Ca2+ oscillations reflect VEGFR signaling-regulated angiogenic capacity in vivo (2015)
  • Author(s): Yokota, Y., Nakajima, H., Wakayama, Y., Muto, A., Kawakami, K., Fukuhara, S., and Mochizuki, N.
  • Journal Title: eLife Volume: 4 Pages: e08817
  • DOI: 10.7554/eLife.08817
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] The study of amygdala and hippocampal functions in zebrafish (2016)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: FishMed2016
  • Place of Presentation: Warsaw, Poland
  • Year and Date: 2016-03-18 – 2016-03-19
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] ゼブラフィッシュを用いた海馬機能の研究 (2015)
  • Author(s): 田辺 英幸
  • Organizer: 第38回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2015-12-01 – 2015-12-04
• [Presentation] ゼブラフィッシュ研究の最前線 (2015)
  • Author(s): 川上浩一
  • Organizer: 第49回日本実験動物技術者協会総会
  • Place of Presentation: 静岡
  • Year and Date: 2015-10-09 – 2015-10-10
  • Invited
• [Presentation] The study of amygdala and hippocampal functions in zebrafish (2015)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: Imaging the Nervous System, Univ of Cambridge
  • Place of Presentation: Cambridge, UK
  • Year and Date: 2015-09-09 – 2015-09-10
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] The study of amygdala and hippocampal functions in zebrafish (2015)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: Zebrafish Disease Models Conference
  • Place of Presentation: Boston, USA
  • Year and Date: 2015-08-24 – 2015-08-27
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Genetic dissection of the fear circuit in zebrafish (2015)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: The 38th Annual Meeting of the Japan Neuroscience Society
  • Place of Presentation: Kobe
  • Year and Date: 2015-07-28 – 2015-07-31
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Functional dissection of the zebrafish telencephalon by the Gal4-UAS approach (2015)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: Circuits and Behavior in Tuscany
  • Place of Presentation: Montecastelli, Italy
  • Year and Date: 2015-06-21 – 2015-06-26
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Functional dissection of the zebrafish telencephalon by the Gal4-UAS approach (2015)
  • Author(s): Koichi Kawakami
  • Organizer: The 48th Annual Meeting for the Japanese Society of Developmental Biologists
  • Place of Presentation: Tsukuba
  • Year and Date: 2015-06-02 – 2015-06-05
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Remarks] zTrap
  • URL: http://kawakami.lab.nig.ac.jp/ztrap/
• [Remarks] ZeBrain
  • URL: http://zebrain.nig.ac.jp/zebrain/