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2015 Fiscal Year Annual Research Report

情報蛋白質のリン酸化による細胞記憶の新たな分子機構

Research Project

Project/Area Number 15H02394
Research InstitutionInstitute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

佐甲 靖志  国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 主任研究員 (20215700)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 日比野 佳代  国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 助教 (40435673)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2019-03-31
Keywords細胞情報・動態
Outline of Annual Research Achievements

本研究は、細胞内情報処理蛋白質の多重リン酸化を利用した新たな細胞記憶の形成・保持機構を研究し、その分子機構に由来する細胞個性の発現や遺伝的変異による発病の理解を目指している。動物細胞の持つリン酸化酵素RAFは、細胞内情報処理ネットワークの要となる反応要素である。我々は最近、細胞内のRAF分子の平均構造が細胞ごとに異なっており、それが増殖因子に対する細胞ごとのRAFの応答性の違いと強く相関していること、さらに、RAFの構造分布が、分子内の複数のアミノ酸残基のリン酸化の組み合わせによって制御されていることを示す実験結果を得た。この結果は、各々の細胞が経験してきたリン酸化酵素活性化の履歴がRAF分子に埋込まれ、細胞応答を決定していることを示唆している。この現象の実態と意義を解明することが目標である。
RAFの構造は、両端にGFPとTMR-Halo tagを結合したプローブ分子を用いて、末端間のFRET信号変化によって検出する。本年度は今後の研究へ向けた準備段階として、種々のリン酸化変異体を基にしたRAF構造検出プローブを作成し、また、photon counting histogramによる細胞内1分子構造分布計測装置を作成し、さらに、in vitroでの1分子構造変化計測系、長時間1細胞計測法などを開発した。様々な組み合わせでリン酸化部位に変異を持つ構造検出プローブの1細胞計測と、部位特異的なリン酸化の検出から、構造制御におけるリン酸化の上下関係・相関関係などが見えてきた。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

RAF分子内の3つのリン酸化部位(S259, S338, S621)の各々に対してリン酸化阻害、或いはリン酸化模倣する変異体、およびこれらの2重変異体の構造計測を行った。S259, S621のリン酸化、S338のリン酸化阻害はRAFの構造を閉じると共に、RAFの細胞膜局在を妨げて活性化に阻害的であるのに対し、S259、S621のリン酸化阻害、S338のリン酸化はRAFの構造を開き、RAFの細胞膜局在を促進した。2重変異体ではS621のリン酸化が支配的であり、リン酸化を阻害すると他の変位にかかわらずRAFの構造を開いて細胞膜局在させた。
野生型および変異体プローブ分子のリン酸化を生化学計測したところ、S259のリン酸化酵素であるとされるAKTはむしろS621のリン酸化亢進作用が強く、野生型、変異体あるいは細胞に対するEGF刺激の有無を通じてS259とS621のリン酸化に強い相関が見出された。両者はいずれもRAFの構造を閉じて活性を阻害する作用があると考えられる。
以上の結果は細胞全体から得られた、すなわち多数分子平均の発光スペクトル計測による。単一細胞内のRAF分子構造分布を得るため、共焦点光学系を利用して細胞質中の単一分子からのFRET信号を個別に計測するphoton counting histogram計測装置を組み立てた。予備的結果からは、平均構造は2ないし3状態の分布比の違いで決まっていると予想された。1分子FRET時系列から状態変化の計測を行うため、ガラス基板への蛍光蛋白質の固定法を検討し、非特異吸着を抑制して安定な計測が可能になった。また、単一細胞内のFRET時系列変化計測の方法を開発し、3日以上の連続計測で、細胞周期を越える長時間データ取得が可能になった。

Strategy for Future Research Activity

本年度は研究計画の第一年目であり、種々の計測準備を行った。いずれもほぼ順調に進行し、次年度以降の本格的計測への十分な見通しが得られた。
本研究ではRAFの分子記憶が多住リン酸化を通じて分子の構造へ埋め込まれ、それがRAFとRASあるいはRASを活性化・不活性化するリン酸化酵素分子、さらにRAFの基質分子との相互作用制御を通してMAPKシステムによる遺伝子発現制御に関わって、細胞運命を調節していると考える。この仮説を検証するため、次年度以降は、本年度に準備したプローブや開発した方法を利用して研究を進める。来年度は特に、細胞内1分子計測により、RAFの構造分布とその決定要因を明らかにすることが重要課題である。

  • Research Products

    (12 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (4 results) (of which Peer Reviewed: 4 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 7 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] State transition analysis of spontaneous branch migration of the Holliday junction by photon-based single-molecule fluorescence resonance energy transfer.2016

    • Author(s)
      Okamoto, K. and Sako, Y.
    • Journal Title

      Biophys. Chem.

      Volume: 209 Pages: 21-27

    • DOI

      10.1016/j.bpc.2015.11.004

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Conversion of graded phosphorylation into switch-like nuclear translocation via autoregulatory mechanisms in ERK signaling.2016

    • Author(s)
      Shindo, Y., Iwamoto, K., Mouri, K., Hibino, K., Tomita, M., Kosako, H., Sako, Y., and Takahashi, K.
    • Journal Title

      Nat. Comm.

      Volume: 7 Pages: 10485-1-10

    • DOI

      10.1038/ncomms10485

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Switching of the positive feedback for RAS activation by a concerted function of SOS membrane association domains.2016

    • Author(s)
      Nakamura, Y., Hibino, K., Yanagida, T., and Sako, Y.
    • Journal Title

      Biophys. Physicobiol.

      Volume: 13 Pages: 1-11

    • DOI

      10.2142/biophsico.13.0_1

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Interaction of a novel fluorescent GTP analogue with the small G-protein K-Ras.2015

    • Author(s)
      Iwata, S., Masuhara, K., Umeki, N., Sako, Y., and Maruta, S.
    • Journal Title

      J. Biochem.

      Volume: 159 Pages: 41-48

    • DOI

      10.1093/jb/mvv071

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 1分子計測で見るEGF受容体の細胞膜動態2016

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      蛋白研セミナー
    • Place of Presentation
      大阪大学、吹田
    • Year and Date
      2016-03-04
    • Invited
  • [Presentation] 細胞内情報処理反応の1分子可視化計測2016

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      CBI学会 第370回研究講演会
    • Place of Presentation
      東京大学、東京
    • Year and Date
      2016-03-03
    • Invited
  • [Presentation] 細胞膜受容体の動的会合体形成と機能2015

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      第13回JCGGシンポジウム
    • Place of Presentation
      ウインク愛知、名古屋
    • Year and Date
      2015-10-01
    • Invited
  • [Presentation] Single-molecule analysis of cell signaling reactions2015

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      第3回 少数性成物学トレーニングコース
    • Place of Presentation
      大阪大学、吹田
    • Year and Date
      2015-08-01
    • Invited
  • [Presentation] 情報伝達蛋白質RAFの疾病変異体のコンフォメーションと機能のイメージング計測2015

    • Author(s)
      日比野佳代、上田昌宏、佐甲靖志
    • Organizer
      第67回 日本細胞生物学会大会
    • Place of Presentation
      タワーホール船堀、東京
    • Year and Date
      2015-07-01
    • Invited
  • [Presentation] RAS-MAPK systemの可視化反応解析 1分子病理・薬理学の可能性2015

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      岡山大学大学院薬学研究科セミナー
    • Place of Presentation
      岡山大学、岡山
    • Year and Date
      2015-06-26
    • Invited
  • [Presentation] 1分子計測で細胞内反応システムを理解する2015

    • Author(s)
      佐甲靖志
    • Organizer
      第12回 原子・分子・光科学 (AMO) 討論会
    • Place of Presentation
      東京大学、東京
    • Year and Date
      2015-06-20
    • Invited
  • [Remarks] 佐甲細胞情報研究室Webpage

    • URL

      http://www.riken.go.jp/cell-info/

URL: 

Published: 2017-01-06  

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