2017 Fiscal Year Annual Research Report
情報蛋白質のリン酸化による細胞記憶の新たな分子機構
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15H02394
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
佐甲 靖志 国立研究開発法人理化学研究所, 佐甲細胞情報研究室, 主任研究員 (20215700)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日比野 佳代 国立遺伝学研究所, 構造遺伝学研究センター, 助教 (40435673)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 細胞情報・動態 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、細胞内情報処理蛋白質の多重リン酸化を利用した新たな細胞記憶の形成・保持機構を研究し、その分子機構に由来する細胞個性の発現や遺伝的変異による発病の理解を目指している。動物細胞の持つリン酸化酵素RAFは、細胞内情報処理ネットワークの要となる反応要素である。我々は最近、細胞内のRAF分子の平均構造が細胞ごとに異なっており、それが増殖因子に対する細胞ごとのRAFの応答性の違いと強く相関していること、さらに、RAFの構造分布が、分子内の複数のアミノ酸残基のリン酸化の組み合わせによって制御されていることを示す実験結果を得た。この結果は、各々の細胞が経験してきたリン酸化酵素活性化の履歴がRAF分子に埋込まれ、細胞応答を決定していることを示唆している。この現象の実態と意義を解明することが目標である。
RAFの構造は、両端にGFPとTMR-Halo tagを結合したプローブ分子を用いて、末端間のFRET信号変化によって検出可能である。本年度はRAF分子構造のリン酸化制御機構の詳細を明らかにするために、S338~Y341のリン酸化部位クラスターにおける網羅的な変異体解析を行うと共に、細胞内RAFの構造分布と分子活性を解析するための１分子反応計測を行った。S338/9はRAFその他のリン酸化酵素によって、Y340/1はSrcによってリン酸化されると言われており、それらのリン酸化はRAFの活性化と結びついているという報告があるが、矛盾する結果も出ており、全貌は明らかでない。その背景には、リン酸化部位の間の複雑な正負の相関関係があることが考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々のこれまでの研究で、RAF分子のS259, S338/9, S621のリン酸化が構造制御に関わることが分かっている。中でもS338/9のリン酸化はRAFの構造を開き、活性を上昇させる。またY340/1も活性制御に関わるリン酸化部位と言われているが、その働きは先行研究間で不一致が見られ、詳細は明らかでない。野生型及びS338/9, Y340/1のリン酸化(D置換)・非リン酸化(A置換)模倣変異体８種を作成し、EGF添加前後の細胞内構造をFRET計測すると共に、S259, S621のリン酸化計測を行った。その結果、S259とS621のリン酸化は共同的に起こりRAFの構造を閉じるが、EGFにより両部位が脱リン酸化して構造が開くこと、S338/9のリン酸化は単独ではRAFの構造と相関せず、Y340/1のリン酸化は構造を閉じてEGFによる構造変化を抑制するが、S338/9, Y340/1のリン酸化が同時に起こるとRAFの構造が開いてEGF応答が大きくなることなど、複雑に相関したリン酸化制御が示唆された。
また、細胞内RAFの構造分布と活性化型RASの認識反応を計測するため、蛍光プローブRAFを発現した細胞を破砕して得た細胞質中のRAF分子を、ガラス基盤に固定した活性型RASと相互作用させ、１分子FRETによるRAF構造の計測とRAS/RAF間の結合・解離反応計測を行う実験系を構築した。現在、RAS/RAFの結合時間分布計測から、RAFの活性と構造の関係が明らかになりつつある。この方法は、RAFだけでなく、RalGDSやPI3Kなど多くのRASエフェクターの活性計測に応用可能である。
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| Strategy for Future Research Activity |
RAFの主要なリン酸化部位の内、S338/9, Y340/1の変異体に関しては詳細が明らかになってきた。また、S621はRAFの構造のマスターレギュレータとも言えるリン酸化部位であり、リン酸化阻害によりRAFの構造が完全に開き、RASとdead end 複合体を形成することを明らかにしている。今後は、もう一つの重要なリン酸化部位であるS259と他のリン酸化部位との制御関係を明らかにする。また、各々のリン酸化部位変異体のEGF応答を明らかにするために、全反射蛍光顕微鏡を用いた細胞膜結合と分子構造の１分子計測を行う。単一細胞内でのRAF構造変化の長期記録も続ける。以上の研究から、RAFの構造制御と細胞応答、RAF構造に埋めこまれた細胞記憶の様相を明らかにする。
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Research Products
(13 results)
