2015 Fiscal Year Annual Research Report
微生物のシステイングリコシダーゼの構造機能解析と反応機構解明
| Project/Area Number |
15H02443
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 伊藤細胞制御化学研究室, 専任研究員 (70342748)
藤田 清貴 鹿児島大学, 学術研究院農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
|
| Keywords | 酵素 / 蛋白質 / 有機化学 / 応用微生物 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々はGHファミリー127に分類されるβ-L-アラビノフラノシダーゼの結晶構造解析に成功し、その活性中心（求核触媒）が亜鉛に結合したCys残基であることを示した。プロテアーゼでは求核性触媒残基がCysである酵素がよく知られているが、糖質加水分解酵素では前例のない発見であったために、その反応機構についてはさらなる検証が必要である。本研究ではβ-L-アラビノフラノシド結合に作用する酵素の反応機構の詳細を明らかにするために、新規に開発する自殺基質や特異的阻害剤、反応中間体を模した擬似基質などを利用して構造機能解析を行なう。また本酵素は微生物ゲノム中に多数のホモログが存在し、同様の反応を触媒するGH121の酵素も存在する。これらを利用した解析も行い、特殊な反応機構の普遍性について調べる。
本年度までに以下のような成果が得られた。まず、HypBA1を用いて、合成基質であるpNP-β-L-アラビノフラノシドとE322変異体の複合体構造を取得した。HypBA2の立体構造をGH121に属する酵素として初めて決定することに成功した。本構造の決定には、セレノメチオニンを用いたSAD法を用いた。HypBA2はN末端側のβ-サンドイッチドメインとC末端側のバレルフォールドを持つ触媒ドメインからなっていた。さらに、ビフィズス菌と植物病原菌が持つHypBA1ホモログの結晶化条件を決定した。また、合成基質methyl-β-L-アラビノフラノシドの合成と供給を行なった。ホモログの機能解析を行い、植物病原菌であるXanthomonas属の持つホモログの機能解析も部分的に行なった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）HypBA1の構造機能解析
脱離しやすいアグリコンと、グリコシル化-脱グリコシル化の両段階をアシストする酸/塩基触媒残基(E322)の変異体の組み合わせを用いることにより、中間帯がトラップされた構造を得ることを目指した。HypBA1の結晶自体は良い再現性で得られるが、通常は活性部位がディスオーダーした構造しか得られず、研究開始時点で得られていた複合体は高濃度のアラビノースと還元剤存在下の共結晶でしか得られていなかった。H27年度の研究により、pNP-β-ArafとE322変異体の複合体構造が得られた。また、HypBA2の立体構造をGH121に属する酵素として初めて決定することに成功した。さらに、ビフィズス菌と植物病原菌が持つHypBA1ホモログの結晶化条件を決定した。
２）システイングリコシダーゼの阻害剤および中間体アナログの合成
合成基質methyl-β-L-arafの合成を行い、東大グループと鹿児島大グループの両方にそれぞれ10 mg以上提供した。
３）GH127-DUF1680とGH121の構造機能解析
H27年度中に、B. longumが持つホモログの機能解析を行い、Xanthomonas属（植物病原菌）の持つホモログの機能解析にも着手した。これらの機能解析により、いずれもβ-L-アラビノフラノシダーゼであることが明らかになった。
|
| Strategy for Future Research Activity |
１）HypBA1の構造機能解析
その他の基質アナログのソーキングに加えて、理研グループで作成した自殺基質の利用、C417変異体の利用、などを試す。また、金属フリーのアポ酵素を調製して、Zn2+や他の金属イオンに対する結合定数や金属置換酵素の活性などを調べる。GH121に関してはH27年度中にアポ体の構造決定に成功したので、本年度は複合体の構造解析を目指す。また、B. longumと植物病原菌のDUF1680ホモログ（いずれも機能解析ずみ）の結晶化にも成功したので、今後、これらの構造決定を目指す。
２）システイングリコシダーゼの阻害剤および中間体アナログの合成［担当：理研］
HypBA1の活性中心構造に対応した自殺基質、阻害剤を合成し、東大および鹿児島大グループに提供する。
３）GH127-DUF1680とGH121の構造機能解析
B. longumが持つホモログとXanthomonas属（植物病原菌）の持つホモログの機能解析に加えて、これらの遺伝子の生化学的機能解析をさらに進める。植物病原菌のHypBA1遺伝子の破壊株を作成し、病原性に与える影響を調べる。
|
