2018 Fiscal Year Annual Research Report
Structure-function analysis and study on reaction mechanism of microbial cysteine glycosidases
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15H02443
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤田 清貴 鹿児島大学, 農水産獣医学域農学系, 准教授 (20381189)
石渡 明弘 国立研究開発法人理化学研究所, 開拓研究本部, 専任研究員 (70342748)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2019-03-31
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| Keywords | 酵素 / タンパク質 / 有機化学 / 応用微生物 / 糖鎖 / 糖質関連酵素 / 植物病原菌 / 選択的化学合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はGH127およびGH146に分類されるβ-L-アラビノフラノシダーゼ(β-L-Araf-ase)の結晶構造解析に成功し、その求核触媒が亜鉛に結合したCysであることを示した。これは糖質加水分解酵素では前例のない発見であったために、その反応機構についてはさらなる検証が必要であった。本研究ではβ-L-アラビノフラノシド結合に作用する酵素の反応機構の詳細を明らかにするため、類似酵素の探索、新規に開発する自殺基質や特異的阻害剤、反応中間体を模した擬似基質などを利用して構造機能解析を行った。
ビフィズス菌の持つβ-L-Araf-aseホモログとして２種類の新規なGH146酵素(BLL3とBLL4)の機能解析を行い、両者の基質特異性を明らかにした。特にBLL3はAraf-β1,3-Araf結合を特異的に切断する新規性の高い酵素であった。
同ホモログとしてBLL3と植物病原菌キサントモナス属由来新規酵素XCCの構造解析に成功した。これらはいずれもGH146に属し、特に後者では新規な糖質結合ドメインの存在が明らかとなった。
β-L-Araf-aseの阻害剤開発を行い、システイン残基と化学選択的に反応可能な１位ハロアセトアミド体の立体選択的合成法を確立した。このようなデザインの阻害剤は糖質加水分解酵素としては初めてである。どちらもβ-L-Araf-aseを強く阻害し、両者で複合体の結晶構造解析にも成功した。特にβ-体ではアミド基がα-側に回り込んで触媒システイン残基に共有結合しており、非常に珍しい阻害機構であった。
我々はこれまでβ-L-Araf-aseの反応前の基質-酵素（ミカエリス）複合体、反応産物との複合体との構造決定に成功しており、今回反応中間体のアナログの構造決定にも成功したことから、β-L-Araf-aseの反応機構をステップごとの立体構造とともに解明することに成功した。
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| Research Progress Status |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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