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2016 Fiscal Year Annual Research Report

常染色体優性遺伝病モデル遺伝子改変ブタにおける病態発症機構の解明と表現型制御

Research Project

Project/Area Number 15H02480
Research InstitutionMeiji University

Principal Investigator

長嶋 比呂志  明治大学, 農学部, 専任教授 (50318664)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 大鐘 潤  明治大学, 農学部, 専任准教授 (50313078)
Project Period (FY) 2015-04-01 – 2019-03-31
Keywordsブタ / 遺伝子改変動物 / 常染色体優性遺伝病 / ハプロ不全 / マルファン症候群モデル / エピジェネティクス / CpG shore / メチル化修飾
Outline of Annual Research Achievements

ハプロ不全として定義されている優性遺伝病の発症機序を明らかにするために、マルファン症候群モデル動物であるヘテロFibrillin 1遺伝子(FBN1)変異ブタを作出し、表現型(病態)の解析を実施した。得られた解析結果は原著論文(Umeyama et al.,2016 Sci Rep. 6:24413)として発表した。
続いて、正常FBN1と変異FBN1のそれぞれのプロモーター領域のメチル化状態の確認を実現するため、FBN1変異ブタとは異なるSNPをFBN1プロモーターに持つミニブタを特定した。このブタを交配に用いて、正常FBN1アリルと変異FBN1アリルを、FBN1プロモーターCpG shore内のSNPを指標に判別できるヘテロ変異個体を得た。
さらに、FBN1プロモーターCpG shoreでの細胞種特異的DNAメチル化およびそのゆらぎの確立時期を特定する目的で、生殖細胞および初期発生胚でのDNAメチル化状態を検討した。その結果、卵での高メチル化が受精後の初期発生過程で初期化による脱メチル化を受け、その後の器官形成期に向けて再メチル化が亢進することが明らかになった。これらの本年度成果と昨年度の成体組織の解析結果を統合し、原著論文(Arai et al., 2017 J Reprod Dev, in press)として発表した。また、プロモーターCpG shore内にアリルを区別できるSNPを持つミニブタとの交配から作製されたFBN1ヘテロ欠損ブタの新生仔尾部より線維芽細胞を樹立し、次年度の正常・変異アリルを区別したDNAメチル化解析のための基盤構築に成功した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ヘテロFBN1変異ブタを作出後、その表現型(病態)の基礎データを得る事に成功し、原著論文にまとめた。続いて、正常FBN1アリルと変異FBN1アリルとの識別が可能なヘテロ変異個体が得られたことは、来年度計画への準備が整ったことを意味する。従って、当初の計画通り研究は進んでいると考えている。
FBN1プロモーターCpG shoreでの細胞種特異的DNAメチル化状態の開始時期を同定し、ゆらぎの起きる時期を特定するための検討を終了した。さらにゆらぎの起きる時期を特定するための正常・変異アリルを区別したDNAメチル化解析が可能な新生仔線維芽細胞の樹立にも成功したことから、当初の計画通り研究は進んでいると考えている。

Strategy for Future Research Activity

2016年度にはFBN1プロモーターCpG shoreの一塩基多型(SNP)を有する、FBN1変異F1個体群を作出した。これらの個体を継続飼育し、病態発現動態を追跡調査すると同時に、適宜採材を行い、正常・変異アリルを区別したFBN1 CpG shoreのDNAメチル化解析を行う。さらに、FBN1の発現抑制を目的としたRNA干渉を試みる。具体的には、ヒトU6 RNA pol IIIプロモーター制御下で恒常的に短ヘアピンRNA(short hairpin RNA; shRNA)を発現するベクターを用いて、FBN1 mRNAをノックダウンさせる。ゲノム編集技術を用いて、本ベクターを片方のアレルに存在するFBN1のエキソンに導入し、ヘテロFBN1ノックアウト(KO)状態のブタ胎仔線維芽細胞を樹立する。この細胞では、本ベクターから発現するshRNAの作用により、もう一方の正常FBN1 から転写されるmRNAがノックダウンされることになる。このストラテジーにより、FBN1の発現量がヘテロFBN1-KOとホモFBN1-KOの中間になる細胞株を樹立する。
プロモーターCpG shoreにSNPを有するFBN1ヘテロF1について、新生仔の尾部よりFBN1を高発現する線維芽細胞を樹立する。プロモーターSNPの確認が取れたヘテロ欠損細胞株について、バイサルファイトシーケンス法により正常・変異アリルを区別したDNAメチル化解析を行い、特に正常アリルのメチル化状態とFBN1 mRNA発現量との相関を検討する。また、DNAメチル化状態を変更する薬剤(5-aza-dC、葉酸、ホモシステインなど)の添加により、FBN1プロモーターCpG shoreでのメチル化状態の改変を試み、正常FBN1 mRNA発現の変化を誘導できるかどうかも検討する。

  • Research Products

    (17 results)

All 2017 2016

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Presentation (13 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 6 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Establishment of DNA methylation patterns of the Fibrillin1 (FBN1) gene in porcine embryos and tissues2017

    • Author(s)
      Arai Y, Umeyama K, Takeuchi K, Okazaki N, Hichiwa N, Yashima S, Nakano K, Nagashima H, Ohgane J
    • Journal Title

      J Reprod Dev

      Volume: 63 Pages: 157-165

    • DOI

      10.1262/jrd.2016-158

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Involvement of DNA methylation in regulating rat Prop1 gene expression during pituitary organogenesis2017

    • Author(s)
      Nishihara H, Yoshida S, Kanno N, Nishimura N, Ueharu H, Ohgane J, Kato T, Kato Y
    • Journal Title

      J Reprod Dev

      Volume: 63 Pages: 37-44

    • DOI

      10.1262/jrd.2016-102

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Generation of heterozygous fibrillin-1 mutant cloned pigs from genome-edited foetal fibroblasts2016

    • Author(s)
      Umeyama K, Watanabe K, Watanabe M, Horiuchi K, Nakano K, Kitashiro M, Matsunari H, Kimura T, Arima Y, Sampetrean O, Nagaya M, Saito M, Saya H, Kosaki K, Nagashima H, Matsumoto M
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 6 Pages: 24413

    • DOI

      10.1038/srep24413

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] アリルごとのDNAメチル化状態に注目したエピジェネティクス解析の新たな試み2017

    • Author(s)
      大鐘潤、新井良和
    • Organizer
      2017年日本農芸化学会年会シンポジウム
    • Place of Presentation
      京都
    • Year and Date
      2017-03-17 – 2017-03-20
    • Invited
  • [Presentation] クローン動物と遺伝子改変2016

    • Author(s)
      長嶋比呂志
    • Organizer
      染色体学会第67回年会(市民講座)
    • Place of Presentation
      東京
    • Year and Date
      2016-11-03 – 2016-11-03
    • Invited
  • [Presentation] 変異型fibrillin-1遺伝子を有するブタの上行大動脈の病理解析2016

    • Author(s)
      梅山一大, 新井良和, 中野和明, 内倉鮎子, 渡邊将人, 松成ひとみ, 齋藤正寛, 木村徳宏, 渡邊航太, 堀内圭輔, 北城雅照, 有馬好美, サンペトラオルテア, 小崎健次郎, 佐谷秀行, 松本守雄, 長屋昌樹, 大鐘潤, 長嶋比呂志
    • Organizer
      第57回日本脈管学会総会
    • Place of Presentation
      奈良
    • Year and Date
      2016-10-13 – 2016-10-15
  • [Presentation] 疾患モデルブタ・ミニブタ開発の現状と展望2016

    • Author(s)
      長嶋比呂志
    • Organizer
      第4回日本先進医工学ブタ研究会
    • Place of Presentation
      三島
    • Year and Date
      2016-10-06 – 2016-10-07
    • Invited
  • [Presentation] FBN1遺伝子変異を有するマルファン症候群モデルブタ由来の脱分化脂肪細胞株(DFAT)樹立と特性解析2016

    • Author(s)
      酒井成貴, 信末博行, 有馬好美, 梅山一大, 長嶋比呂志, 佐谷秀行, 貴志和生
    • Organizer
      第25回日本形成外科学会基礎学術集会
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2016-09-15 – 2016-09-16
  • [Presentation] ハプロ不全優成遺伝病の発生機序解明に向けた新たなアプローチ:ブタフィブリリン1(FBN1)2016

    • Author(s)
      新井良和, 梅山一大, 竹内健太, 八島紗耶香, 中野和明, 長嶋比呂志, 大鐘潤
    • Organizer
      第109回日本繁殖生物学会
    • Place of Presentation
      相模原
    • Year and Date
      2016-09-12 – 2016-09-15
  • [Presentation] ブタにおけるゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックアウト2016

    • Author(s)
      渡邊将人, 松成ひとみ, 中野和明, 梅山一大, 高柳就子, 長屋昌樹, 宮川周士, 花園豊, 中内啓光, 長嶋比呂志
    • Organizer
      日本ゲノム編集学会第1回大会
    • Place of Presentation
      広島
    • Year and Date
      2016-09-07 – 2016-09-08
  • [Presentation] Pig model of rare monogenic diseases2016

    • Author(s)
      Nagashima H
    • Organizer
      18th International Congress of Animal Reproduction, SALAAM-Workshop
    • Place of Presentation
      Tours, France
    • Year and Date
      2016-06-28 – 2016-06-28
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] ホモ変異型fibrillin-1遺伝子を有するブタの表現型2016

    • Author(s)
      梅山一大, 新井良和, 中野和明, 内倉鮎子, 渡邊將人, 松成ひとみ, 齋藤正寛, 佐谷秀行, 松本守雄, 長屋昌樹, 大鐘潤, 長嶋比呂志
    • Organizer
      第48回日本結合組織学会学術大会
    • Place of Presentation
      長崎
    • Year and Date
      2016-06-24 – 2016-06-25
  • [Presentation] 動物のゲノム編集とその医学応用2016

    • Author(s)
      長嶋比呂志
    • Organizer
      日本ビタミン学会第68回大会
    • Place of Presentation
      富山
    • Year and Date
      2016-06-17 – 2016-06-18
    • Invited
  • [Presentation] Combining breeding and advanced reproduction techniques for regenerative medicine2016

    • Author(s)
      Nagashima H
    • Organizer
      Plant and Animal Genome Asia 2016
    • Place of Presentation
      Singapore, Singapore
    • Year and Date
      2016-06-06 – 2016-06-08
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 体細胞核移植で継代されたクローンブタでのゲノムワイドDNAメチル化解析2016

    • Author(s)
      新井良和、福川斐昭、飛知和尚美、松成ひとみ、長嶋比呂志、大鐘潤
    • Organizer
      第10回日本エピジェネティクス研究会
    • Place of Presentation
      大阪
    • Year and Date
      2016-05-19 – 2016-05-20
  • [Presentation] ゲノム編集ブタにおけるヘテロ変異fibrillin-1遺伝子の後代への伝達と発現2016

    • Author(s)
      梅山一大, 渡辺航太, 渡邊将人, 堀内圭輔, 中野和明, 北城雅照, 松成ひとみ, 長屋昌樹, 松本守雄, 長嶋比呂志
    • Organizer
      第63回日本実験動物学会総会
    • Place of Presentation
      川崎
    • Year and Date
      2016-05-18 – 2016-05-20
  • [Book] 実験医学増刊Vol.34 No.20 All Aboutゲノム編集“革命的技術"はいかにして私たちの研究・医療・産業を変えるのか?2016

    • Author(s)
      渡邊將人, 長嶋比呂志
    • Total Pages
      234
    • Publisher
      羊土社

URL: 

Published: 2018-01-16  

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