2015 Fiscal Year Annual Research Report
GBA遺伝子変異によるパーキンソン病発症機構の解明と治療法開発
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15H02540
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
高橋 良輔 京都大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90216771)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木下 政人 京都大学, (連合)農学研究科(研究院), 助教 (60263125)
秋山 央子 国立研究開発法人理化学研究所, その他部局等, 研究員 (80623462)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | パーキンソン病 / ゴーシェ病 / 脂質 / メダカ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、メダカGBA2をクローニングし、コーディングリージョンの塩基配列を決定した。メダカGBA2は858アミノ酸よりなる蛋白質であった。予定どおり、CRISPR/Cas9 systemによる遺伝子破壊は成功し、ホモ接合型変異体（GBA2－/－）脳におけるメダカGBA2酵素活性の欠失を認めた。またカスタムウサギポリクローナル抗体を作製し、ウェスタンブロッティングにてGBA2蛋白発現の欠失が確認できた。GBA2－/－メダカが生存可能で、少なくとも明らかな形態異常や泳ぎ方の異常を認めないことを確認した。交配によりGBA1+/－GBA2+/－メダカを作製し、同変異体同士の交配によりGBA1－/－GBA2－/－メダカの作製を開始した。さらに、GBA3がGBA1欠損時に病態に関わっている可能性も考え、GBA2と同様にGBA3欠損メダカも作製した。また、GBA1－/－メダカ脳で低下が認められたLipid Xについて、ラット脳を用いて精製・構造解析に成功した。
上記に並行し、α-syn BAC TgマウスとGBAヘテロKOマウスを交配し、その解析を進めた。同変異マウスはα-syn BAC Tgマウスと比較し、12ヵ月齢において脳にリン酸化α-synの蓄積を認めた。この蓄積は特に嗅球や大脳皮質に顕著であり、GBA変異がリン酸化α-syn蓄積を引き起こす機序を解析するため、嗅球を用いてマイクロアレイを行うためのサンプル調整に着手した。また、GBAヘテロ接合型変異（R120W、L444P、RecNciI）を持つパーキンソン病患者由来、さらにGBAホモ接合型変異（L444P/L444P、RecNciI/RecNciI）を持つゴーシェ病患者由来のiPS細胞の樹立に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた通り、CRISPR/Cas9 systemによりGBA2変異メダカを作製することができた。GBA2－/－メダカが外観や泳ぎ方からは明らかな異常を認めないことから、GBA1－/－GBA2－/－メダカの作製・解析は可能であろうと考えている。来年度以降、GBA2－/－メダカそのものの解析と併せて、予定通りGBA1－/－GBA2－/－メダカの解析を進める。Lipid Xについても昨年度内に構造決定ができており、来年度以降に生合成経路決定と生理機能解析に着手することができる。α-syn BAC Tgマウス / GBAヘテロKO交配マウスに関しては、来年度以降にマイクロアレイの解析に加えて、更なる病理学的解析と行動解析を行う予定である。iPS細胞研究に関しても、予定したGBA変異を持つiPS細胞の樹立に成功している。いずれの研究に内容についても現時点では順調で、来年度以降の計画に取り掛かることが可能と考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まずはGBA1－/－GBA2－/－メダカの解析、またGBA3変異メダカの解析とGBA1変異メダカとの交配・解析を進める。解析に関しては、生存期間、病理学的解析に加え、脂質の定量的解析（Glucocerebroside、β-ChlGlc、Lipid Xを含む）を行う。特にβ-ChlGlcとLipid Xに関しては、その生合成経路を明らかにすることを目指す。また、Lipid Xについて、PDとの関与を明らかにするため、GBA変異メダカおよびゴーシェ病患者由来iPS細胞を疾患モデルとして利用し、LC/MSによってβ-ChlGlcとLipid Xの量をコントロールと比較する。また、Lipid Xの生合成経路を明らかにするため、Lipid X代謝への関与が疑われる脂質代謝酵素のノックダウン細胞を作製し、Lipid Xの発現量の変化の有無をLC/MSを用いて検証する。
α-syn BAC Tgマウス / GBAヘテロKO交配マウスに関しては、リン酸化α-synの蓄積が顕著であった嗅球のマイクロアレイを行う。また、更なる病理学的解析と行動解析も行い、パーキンソン病モデルとしての評価を行う。iPS細胞の研究に関しては、GBAヘテロ接合型変異・GBAホモ接合型変異を持ったiPS細胞に関して遺伝子修復を行う。またCORINソーティングによるTH陽性細胞純化技術を確立する。
全体として、GBA1－/－メダカを基とした解析から、病態におけるGBA2とGBA3の関与、またβ-ChlGlc、Lipid Xの関与の解析を目指す。そして、マウスモデルとiPS細胞モデルを用いて、これらの病態への関与を更に解析する。
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Research Products
(15 results)
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[Journal Article] iable Neuronopathic Gaucher Disease Model in Medaka (Oryzias latipes) Displays Axonal Accumulation of Alpha-Synuclein2015
Author(s)
Uemura N, Koike M, Ansai S, Kinoshita M, Ishikawa-Fujiwara T, Matsui H, Naruse K, Sakamoto N, Uchiyama Y, Todo T, Takeda S, Yamakado H, Takahashi R.
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Journal Title
PLoS Genet.
Volume: 11
Pages: e1005065
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The Parkinson's Disease-Associated Protein Kinase LRRK2 Modulates Notch Signaling through the Endosomal Pathway.2015
Author(s)
Imai Y, Kobayashi Y, Inoshita T, Meng H, Arano T, Uemura K, Asano T, Yoshimi K, Zhang CL, Matsumoto G, Ohtsuka T, Kageyama R, Kiyonari H, Shioi G, Nukina N, Hattori N, Takahashi R
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Journal Title
PLoS Genet.
Volume: 11
Pages: e1005503.
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Pathological studies in Parkinson's disease2016
Author(s)
Seiji Kaji, Norihito Uemura, Takakuni Maki, Makoto Urushitani, Ryosuke Takahash
Organizer
Symposium for Young Neurologists and Emerging Researchers Grooming for Interaction and Excellence in Science (SYNERGIES)
Place of Presentation
マニラ
Year and Date
2016-03-10 – 2016-03-10
Int'l Joint Research
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