2015 Fiscal Year Annual Research Report
Cancer fluid biopsy for childhood malignancies using one cell analysis
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15H02567
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
檜山 英三 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 教授 (00218744)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
金輪 真佐美 (福永真佐美) 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 助教 (00284208)
栗原 將 広島大学, 病院(医), 医科診療医 (40724894)
外丸 祐介 広島大学, 自然科学研究支援開発センター, 教授 (90309352)
上田 祐華 広島大学, 病院(医), 病院助教 (70624641)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌 / 細胞、組織 / 核酸 / バイオテクノロジー / 臨床 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
広島大学に保存し、既に病理分類と予後調査が完了した神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫のうち、治療前の初代培養にて腫瘍細胞が選別され、凍結病理検体および血漿が同時に保存されている164検体、樹立株24株、腹水・胸水69検体、治療前と経過中の血漿検体約964検体を対象とした。1.腫瘍特異的選別マーカーの検出:質量顕微鏡を用いて、腫瘍の蒸着固定組織を作製し細胞表面の特異的な局在蛋白等同定を試みたが、ほとんどが脂質を含む細胞壁成分であった。
2.一細胞解析(セロミクス解析)と一細胞ゲノム解析(ゲノミクス解析)：細胞株24株のがん幹細胞分画を用いて細胞1個のレベルでの網羅的蛋白発現を試みたが、ピークが50-60と少なく、再度条件検討を行った。これらに用いた細胞から、一細胞ごとの特徴的な遺伝子変化、遺伝子発現を現有する次世代シークエンサー(NGS)による解析を行い、一細胞内のゲノムの増幅、遺伝子発現レベルの検討が可能となった。
3.細胞株上清、血漿中のマーカー検索：細胞の培養上清から、蛋白、遊離DNA,エクソームを採取し、microRNAを中心に検討し、その発現レベルから予後関連microRNAを数個選別した。さらに、血漿中Cell Free DNA（cfDNA)を抽出し、NGSにて変異検出を行なった。βカテニン遺伝子(CTNNB1遺伝子)等の変異は検出できたが、欠失に関しては感度が低く、再度プローブ等を検討をしている。
4.Cancer fluid biopsyとして、担癌患者の全血からCD45などの表面マーカーCD45にて造血系細胞を除去し、サイトケラチンを含めたがん幹細胞マーカーを用いてCTC(循環腫瘍細胞)を導入した細胞濃縮装置(IsoFluxxシステム)にて濃縮分離採取して解析した。
上記の結果から、Cancer fluid biopsyの有効性を示し、臨床への応用法を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
広島大学に保存し、既に病理分類と予後調査が完了した神経芽腫、肝芽腫、腎芽腫を含む約1000例のうち、治療前の初代培養にて腫瘍細胞が選別され、凍結病理検体および血漿が同時に保存されている200検体、樹立株23株を対象にする。また、腹水・胸水80検体、治療前と経過中に採取した血漿検体約2000検体を検討することとして研究を行なっており、一時NGSの機器故障などで研究が少し滞ったが、現在は血漿では1000検体を超える検討ができており、概ね順調に進んできると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度以降は、広島大学に現有検体を中心に検索し、前臨床試験段階の検討を行なう。また、必要に応じてバイオバンクなどの腫瘍バンクからの供給を依頼する。
１.一細胞解析(セロミクス・ゲノミクス解析)：によるバイオマーカーの確定:質量顕微鏡を用いた検索を計測し、さらに初代分離細胞の質量分析解析およぶNGS解析から、腫瘍別の診断マーカーあるいは個体別の経過観察のマーカーを確定する。
２．血液中CTC細胞、遊離核酸解析：診断時および経過中の患者血液から循環腫瘍細胞(CTC)を抽出し、CTCであることを確認するとともに、CTC分離の有用なマーカーを検索する。血漿や血清から得られる遊離DNAおよびエクソソーム抽出によるRNAを用いたがん診断マーカーの診断法を確定する。特に腫瘍特異的な遺伝子変異、転座などの検出法、特異的なタンパクや抗体などの検出法を確立する。
３.Cancer fluid biopsyへの応用：実際の小児がん症例から、全血を採取しからCD45による造血系細胞を除去し、さらにがん幹細胞マーカーにてCTC（循環腫瘍細胞）を分離採取し、これらから上記のCTC分離と、遊離核酸解析を行い、実際の診断、治療効果の判定、早期再発のモニタリングへの有用性を検証し、ベッドサイドで検証できるシステムを構築する。
４.できれば、前臨床試験システムとしてのセルテスティングとアニマルテスティングを行なう：分子標的への抗体、阻害剤、あるいは抑制実験によって、マーカー変動を一細胞解析評価するシステムを構築する。また、免疫不全マウスの接種した腫瘍に対するこれらの治療薬の効果を、マウスへ局所あるいは全身投与し、作成された腫瘍にてその有効性と安全性を検証し、セルテスティングとアニマルテスティングから、臨床試験への候補の選別と共に、個々の腫瘍に有効な薬剤の選別システムを確立する。
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[Journal Article] High glucose promotes TGF-β1 production by inducing FOS expression in human peritoneal mesothelial cells2016
Author(s)
Kokoroishi K, Nakashima A, Doi S, Ueno T, Doi T, Yokoyama Y, Honda K, Kanawa M, Kato Y, Kohno N, Masaki T.
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Journal Title
Clin Exp Nephrol.
Volume: 20
Pages: 30-38
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Chlorinated Water Modulates the Development of Colorectal Tumors with Chromosomal Instability and Gut Microbiota in Apc-Deficient Mice2015
Author(s)
Sasada T, Hinoi T, Saito Y, Adachi T, Takakura Y, Kawaguchi Y, Sotomaru Y, Sentani K, Oue N, Yasui W, Ohdan H.
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Journal Title
PLos One
Volume: 10
Pages: -
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Characteristic expression of MSX1, MSX2, TBX2 and ENTPD1 in dental pulp cells2015
Author(s)
Fujii S, Fujimoto K, Goto N, Kanawa M, Kawamoto T, Pan H, Srivatanakul P, Rakdang W, Pornprasitwech J, Saskianti T, Suardita K, Nishimura F, Kato Y.
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Journal Title
Free PMC Article
Volume: 3
Pages: 566-572
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Mortality and morbidity in primarily resected hepatoblastomas in Japan: Experience of the JPLT (Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumor) trials2015
Author(s)
Hiyama E, Hishiki T, Watanabe K, Ida K, Yano M, Oue T, Iehara T, Hoshino K, Koh K, Tanaka Y, Kurihara S, Ueda Y, Onitake Y.
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Journal Title
Journal of Pediatric Surgery
Volume: 50
Pages: 2098-2101
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The Children's Hepatic tumors International Collaboration (CHIC): Novel global rare tumor database yields new prognostic factors in hepatoblastoma and becomes a research model.2015
Author(s)
Czauderna P, Haeberle B, Hiyama E, Rangaswami A, Krailo M, Maibach R, Rinaldi E, Feng Y, Aronson D, Malogolowkin M, Yoshimura K, Leuschner I, Lopez-Terrada D, Hishiki T, Perilongo G, von Schweinitz D, Schmid I, Watanabe K, Derosa M, Meyers R.
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Journal Title
European Journal of Cancer
Volume: 52
Pages: 92-101
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] 予後良好な神経芽細胞腫で高発現していたDHRS3, NR0B1, CYP26A1の機能解析2015
Author(s)
山岡 絵美, 金輪 真佐美, 田川 浩美, 福場 郁子, 久保-林 陽子, 古屋敷 なぎさ, 阿部 裕子, 平野 尚子, 檜山 英三
Organizer
BMB2015（第38回日本分子生物学会年会、第88回日本生化学会大会 合同大会）
Place of Presentation
兵庫県神戸市
Year and Date
2015-12-01 – 2015-12-04
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[Presentation] 霊長類受精卵のガラス化保存2015
Author(s)
外丸祐介, 信清麻子, 吉岡みゆき，畠山照彦，印藤頼子，兼子明久，岡本宗裕，岡原純子，佐々木えりか
Organizer
Cryopreservation Conference 2015
Place of Presentation
愛知県岡崎市
Year and Date
2015-10-28 – 2015-10-29
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[Presentation] Survival and late effects in the risk-stratified hepatoblastoma patients treated by JPLT-2 protocol2015
Author(s)
Hiyama E, Kurihara S, Ueda Y, Hishiki T, Ida K, Iehara T, Oue T, Yano M, Watanabe K, Hoshino K, Ko K, Tanaka Y.
Organizer
2015 ASCO Annual Meeting
Place of Presentation
Chicago, U.S.A
Year and Date
2015-05-29 – 2015-06-02
Int'l Joint Research
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[Presentation] Mortality and morbidity in primarily resected hepatoblastomas in Japan: experience of JPLT (Japanese study group for pediatric liver tumor) trials2015
Author(s)
Hiyama E, Hishiki T, Watanabe K, Ida K, Yano M, Oue T, Iehara T, Hoshino K, Koh K, Tanaka Y, Kurihara S, Ueda Y, Onitake Y.
Organizer
48th Annual Meeting of the Pacific Association of Pediatric Surgeons
Place of Presentation
Jeju, South Kore
Year and Date
2015-05-17 – 2015-05-21
Int'l Joint Research
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