2015 Fiscal Year Annual Research Report
天然物由来の脂質・膜タンパク質複合体が見せる協奏作用と分子機能の解明
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15H03768
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| Research Institution | Toyohashi University of Technology |
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Principal Investigator |
手老 龍吾 豊橋技術科学大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (40390679)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平野 愛弓 東北大学, その他の研究科, 准教授 (80339241)
戸澤 譲 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (90363267)
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| Project Period (FY) |
2015-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 脂質二重膜 / 表面・界面物性 / 膜タンパク質 / 原子間力顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞膜モデル系である脂質二重膜内において、1 つのタンパク質分子が活性化されることで周囲の複数のタンパク質分子に活性状態が伝播する現象について、そのメカニズムを分子レベルで解明することを目的とする。培養細胞系と無細胞タンパク質合成系を併用して制御下での複雑化を行い、複合体としての機能構造とその際に働く分子間相互作用を明らかにする。平成28年度は以下の2つの課題に取り組んだ。
1). 天然物由来の脂質二重膜中の純粋なチャネルタンパク質：無細胞合成により発現した電位依存性K+チャネル(KAT1)の、大豆由来粗精製脂質(asolectin)支持脂質二重膜(SLB)への再構成およびAFM観察を行った。マイカ基板上に形成したasolectin-SLBへのKAT1含有プロテオリポソーム(PL)を融合、およびKAT1-PLを用いたSLB形成によって、KAT1を包含するSLBを作製する条件を確立した。KAT1を含むSLBの原子間力顕微鏡(AFM)観察においては高さ1 - 2 nmのprotrusionが観察され、これらの高さの分布が約1.3 nmとおよび約2.0 nmの2つの成分からなること、これらの存在比がSLB形成過程に依存して変化することを見出した。
2). 細胞から抽出した膜タンパク質のSLBへの再構成：hERGチャネルを発現した培養細胞の膜画分をSLB系へ再構成し、蛍光顕微鏡およびAFM観察を行った。蛍光顕微鏡観察では、膜画分由来の成分が相分離したままSLBに再構成する様子をその場観察して捉えた。膜画分再構成前後のAFM観察から、SLB内に存在するサブミクロンサイズのドメインが膜画分の融合サイトとして働いていることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
実施計画に記述した2つの課題について、上述の通り順調に研究成果を挙げることができている。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成28年度も引き続きasolectin-SLB中でのKAT1、hERGチャネル発現膜画分含有SLBの2つの実験系を用いて、AFM観察による構造および環境に依存した構造変化の観察を行う。KAT1についてはpH依存および膜電位依存を観察することを目指し、必要に応じて溶液セルの改良を行う。hERGチャネルについては抗体標識を行うことで、膜画分中に存在する他の大量のタンパク質からhERGチャネルを同定することを目指す。膜電位感受性色素のSLBへの導入および表面修飾よる膜電位制御のための要素技術を確立する。
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